Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Kimia Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Laboratorium Kimia PAU Pangan dan Gizi IPB, Laboratorium Kultur Jaringan Bagian Patologi dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan IPB Bogor, serta Klinik Farfa Darmaga. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2006 sampai Maret 2007.
Bahan dan Alat
Bahan
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah bubuk kakao lindak bebas lemak non fermentasi. Bubuk kakao ini diperoleh dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember. Bahan lain yang digunakan adalah gula pasir, air panas, dan susu bubuk skim.
Bahan kimia: Asam askorbat, 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH), H2SO4
65%, metanol pro-analisis, 2,2-diphenyl-1-pycrilhydrazyl (DPPH), aquabides, NaCl 0,9%-NaHCO3, CuSO4, pereaksi polin, albumin serum sapi, 1,1,3,3-
tetraetoksipropana (Sigma), asam tiobarbiturat (TBA), buffer fosfat pH3, dan 1- butanol. Standar flavonoid katekin (Sigma), alkohol 90%, etanol 95%, metanol, HPLC, air bebas ion, dan enzim ß-glukoronidase/sulfatase from Helix Pomatia type HP-1 (G 7017, Sigma)
Alat
Alat–alat: tabung vacutainer steril, mikropipet, penangas air, lemari es, gelas piala, vortek, sentrifuse (JOUAN, tipe CR 412), laminar air flow (Holten Laminar air tipe HV 2472), spektrophotometer (Shimadzu), lema ri pendingin, mikroplate reader (BIO-RAD, Benchmark), kuvet, alat pengukur pH, HPLC (Shimadzu CLASS-VP V6.12SP2) dengan kolom C18 (3,9 x 150 mm, 4 µm) dengan detektor UV pada panjang gelombang 280 nm, inkubator, gelas ukur, dan labu takar
Peralatan sekali pakai yang digunakan adalah syringe 50 ml (terumo), syringe 3 ml, tabung sentrifuse steril 15 dan 50 ml sekali pakai (corning), lempeng mikro 96 sumur (corning), repeater (eppendorf), dispenser tip (marsh), dan tabung vacutainer ukuran 9 ml.
Metode Penelitian
Pembuatan Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak
Minuman bubuk kakao dibuat dari 4 gram bubuk kakao bebas lemak ditambahkan 2 gram gula dan 2 gram susu bubuk skim kemudian dilarutkan dalam 100 ml air panas. Minuman ini selanjutnya diberi nama mi numan bubuk kakao lindak bebas lemak. Sedangkan minuman untuk kelompok kontrol dibuat dari 2 gram susu bubuk skim ditambah 2 gram gula kemudian dilarutkan dalam 100 ml air panas tanpa penambahan bubuk kakao lindak bebas lemak. Minuman ini selanjutnya diberi nama minuman kontrol. Minuman bubuk kakao lindak bebas lemak maupun minuman kontrol diminum oleh responden dalam keadaan hangat. Penyiapan minuman bubuk kakao bebas lemak dilakukan bersama dengan tim (Erniati 2007; Kusumantias 2007; Amri 2007; Hasanah 2007).
Persiapan Responden
Kriteria seleksi responden yang terlibat dalam penelitian ini antara lain: berjenis kelamin perempuan atau mahasiswi Institut Pertanian Bogor, umur 22-27 tahun, sehat atau tidak menderita penyakit yang serius berdasarkan tes dokter yang ditunjuk, bertempat tinggal di lokasi yang sama, dan bersedia menandatangani informed konsent. Pemeriksaan kesehatan terhadap responden dilakukan oleh seorang dokter di Klinik Farfa Darmaga Bogor. Pemeriksaan kesehatan dilakukan sebelum dan sesudah intervensi.
Jumlah responden yang terlibat dalam penelitian ini adalah 18 orang yang dibagi dalam dua kelompok masing-masing beranggotakan 9 orang. Kelompok pertama atau kelompok kakao adalah kelompok yang diintervensi untuk meminum minuman bubuk kakao lindak bebas lemak. Kelompok kedua atau kelompok kontrol adalah kelompok yang diintervensi untuk minum minuman
yang terbuat dari 2 gram gula ditambah susu yang dilarutkan dalam 100 ml air. panas. Penyiapan responden dilakukan bersama-sama dengan tim (Erniati 2007; Kusumantias 2007; Amri 2007; Hasanah 2007).
Pelaksanaan Intervensi (Nurrahman et al 1999)
Intervensi dilaksanakan selama 25 hari di rumah indekos mahasiswi di kompleks perumahan IPB II Sindang Barang. Pelaksanaan intervensi dilakukan setiap hari pada jam 07.00 - 08.00 WIB. Setiap responden pada kelompok kakao diintervensi untuk meminum minuman bubuk kakao yang telah disediakan. Sama halnya dengan kelompok kontrol diintervensi untuk minum minuman yang diperuntukkan untuk kelompok kontrol. Minuman bubuk kakao disiapkan setiap hari oleh peneliti yang sekaligus mengawasi responden meminum minuman bubuk kakao dan susu. Semua responden mendapat sarapan pagi sebelum mengkonsumsi minuman bubuk kakao dan makan malam dengan menu yang seragam. Seminggu sekali selama pelaksanaan intervensi dilakukan diskusi yang melibatkan seluruh responden mengenai penelitian dan kesehatan umum.
Sebelum pelaksanaan intervensi juga dilakukan penandatanganan surat perjanjian (Informed consent) (Lampiran 1) dan wawancara terhadap responden dengan format kuisioner standar (Lampiran 2). Kuisioner tersebut berisi pertanyaan-pertanyaan mengenai status sosial ekonomi, pengetahuan tentang pangan, pola konsumsi, dan kebiasaan membeli makanan jajanan.
Pengukuran Status Gizi (Nurrahman et al 1999)
Pengukuran status gizi responden dilakukan secara antropometri yang meliputi tinggi badan (TB) dan berat badan (BB). Penggolongan status gizi menurut “body mass index” (BMI) dengan satuan Kg/m2, yaitu:
BMI = BB/TB2
Dimana: BMI < 17,0, kekurangan berat badan tingkat berat BMI 17,0 – 18,4, kekurangan berat badan tingkat ringan BMI 18,5 – 25,0, normal
BMI 25,1 – 27,0, kelebihan berat badan tingkat ringan BMI > 27,0, kelebihan berat badan tingkat berat
Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan sebelum dan sesudah responden mengalami intervensi dengan meminum minuman bubuk kakao. Pengambilan darah dilakukan di Klinik Farfa Dramaga pada jam 07.00-08.00 pagi oleh seorang asisten transfusi darah. Darah diambil sebanyak 35 ml dengan menggunakan jarum precisionglide TM steril sekali pakai, kemudian di masukkan ke dalam tabung vacutainer steril yang mengandung antikoagulan. Darah yang diambil dibawa ke Laboratorium Kultur Jaringan Bagian Patologi FKH IPB untuk pemisahan plasmanya.
Plasma Darah
Darah yang telah dimasukkan dalam tabung vacutainer steril yang mengandung antikoagulan dilakukan pemisahan komponen seluler dengan sentrifugasi sampel darah pada 514 g selama 5 menit dengan menggunakan sentrifus dengan rotor swing. Bagian darah yang lebih berat (sel darah merah) berada di bagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah ke bagian atas. Plasma darah diambil atau dipisahkan dengan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang telah disiapkan.
Analisis Vitamin C (Zakaria et al 1996)
Asam askorbat sebanyak 1 gram dilarutkan dalam 1 liter TCA 5% larutan stok. Selanjutnya membuat larutan standar dengan cara mengambil 2 ml larutan stok untuk diencerkan sampai 100 ml dengan TCA 5%. Dari larutan sta ndar dibuat kurva standar dari konsentrasi 1 mg/l sampai 12 mg/l.
Sebanyak 500 µl plasma, blanko dan standar dicampur dengan 100 µl larutan DNPH dengan cara divortek, selanjutnya diinkubasi suhu 37°C selama 4 jam. Kemudian ditambah 750 µl H2SO4 65% dan didiamkan selama satu jam di
dalam ruang gelap. Selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 704 g selama 10 menit, absorbansinya dibaca dengan spektrophotometer pada panjang gelombang 520 nm.
Analisis Aktivitas Antiradikal Bebas Plasma dengan Metode DPPH (Modifikasi Turkmen et al 2005)
Sampel plasma diambil sebanyak 1 ml menggunakan mikropipet 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan ditambah kan metanol pro- analisis 1 ml serta DPPH 0.2 mM sebanyak 1 ml dan dikocok. Tabung kemudian disimpan dalam ruang gelap (tanpa cahaya) selama 60 menit. Sampel di sentrifus pada 704 g selama 10 menit. Sampel kemudian diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Sebagai kontrol digunakan campuran larutan DPPH dan metanol. Absorbansi dari tiap sampel didapat dan aktivitas antioksidannya dihitung dengan menggunakan rumus :
% 100 % x kontrol Absorbansi sampel Absorbansi kontrol Absorbansi n Antioksida Aktivitas = −
Analisis Kadar Malondialdehida (MDA) Plasma (Modifikasi Metode Winarsi 2002; Hong et al 2000)
Mula-mula dibuat berbagai larutan standar MDA dari 1,1,3,3- tetraetoksipropana dengan pelarut air bebas ion dengan konsentrasi 1,25, 1,5, 1,75, 2,25 pmol/µl. Pereaksi dibuat dengan melarutkan 1,728 gram TBA (asam tiobarbiturat) dalam 100 ml buffer fosfat pH 3.
Sebanyak 75 µl sampel plasma atau standar dimasukkan kedalam tabung sentrifus, kemudian ditambahkan 75 µl TCA 20% (dalam 0,6 mol/L HCl). Setelah itu didinginkan dalam lemari pendingin selama 20 menit, campuran tersebut disentrifus pada 704g selama 20 menit. Sebanyak 100 µl supernatan yang diperoleh ditambahkan 20 µl pereaksi TBA dan selanjutnya campuran tersebut dididihkan selama 30 menit. Setelah didinginkan dengan air kran campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroplat 96 sumur dan absorbansinya diukur dengan menggunakan mikroplate reader pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar dibuat dengan memplot nilai absorbansi dengan konsentrasi standar. Konsentrasi MDA plasma dapat dihitung berdasarkan kurva standar.
Analisis Diena Terkonjugasi Plasma (Zakaria et al 2001)
Sampel plasma diencerkan dengan NaCL 0,9 %-NaHCO3 1 mM sampai
konsentrasi protein 10 µg/ml, kemudian dioksidasi dengan penambahan 5 µM CuSO4 (konsentrasi akhir) pada 37°C. Pembacaan absorbansi pada 234 nm
dilakukan setiap 5 menit selama 2 jam. Kadar diena terkonjugasi dihitung dari pengukuran absorbansi (A) pada slope tangen kurva selama fase propagasi dengan koefisien molar ekstingsi (ω ) 234 untuk diena terkonjugasi adalah 29.500 (mol/l)-1 cm-1. Fase lag yang merupakan fase sebelum atau mulai terjadinya oksidasi diukur dari mulai penambahan CuSO4 dengan titik perpotongan tange n
fase propagasi yang diekstrapolasikan ke waktu (absis). Fase lag dinyatakan dengan menit. c b A= . si terkonjuga diena kadar c= kuvet tebal b= absorbansi A= l mol b A c . 500 . 29 =
Analisis Kadar Protein Plasma (Metode Lowry 1951)
Kurva standar dibuat dengan seri pengenceran albumin serum sapi (ASS) 1000 µg/ ml. yaitu 800, 600, 400, 200, 100 µg/ ml. Sebanyak 1,2 ml larutan ASS dari masing-masing pengenceran ditambahkan 6 ml CuSO4alkalis (dengan komposisi 1ml CuSO4.5H2O, 1 ml Na-tartarat 2 %, 98 ml Na2CO3 2 % dalam 0,1 N NaOH). Untuk larutan sampel sebanyak 1.2 ml larutan sample ditambah Cu alkali.
Setelah dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang, ke dalam setiap tabung ditambahkan 0,3 ml pereaksi folin, diaduk dan dibiarkan selama 30 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 650 nm. Kadar protein sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar yang dihasilkan.
Analisa Kadar Flavonoid dalam Plasma (Metode Crespy et al 2001 dan Miean & Mohamed 2001)
Persiapan Sampel. Proses persiapan sampel mengikuti prosedur Crespy et al 2001. Sampel plasma disimpan pada suhu 20o sampai sampel dianalisis lebih lanjut. Sampel plasma diasamkan hingga mencapai pH 4.9 dengan 0,1 volume asam asetat 0,58 ml/L dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 jam dengan penambahan ß-glucoronidase/sulfatase untuk mengubah flavonoid terkonjugasi menjadi aglikon flavonoid bebas. Protein plasma diprepisitasikan dengan cara penambahan 500 µL methanol/200 mmol/L HCL dan ekstraknya disentrifugasi selama 50 menit pada 14000 x g. Setelah ekstraksi tersebut 20 µL dari supernatan diinjeksikan dan dianalisis dengan menggunakan HPLC.
Injeksi Sampel ke dalam HPLC. Proses injeksi sampel ke dalam HPLC mengikuti prosedur Miean & Mohamed 2001. Analisis HPLC dilakukan pada
kondisi sebagai berikut: kolom C18 (3,9 x 150 mm, 4 µm); detektor UV pada panjang gelombang 280 nm; panjang gelombang 280 nm merupakan panjang gelombang optimal penyerapam flavonoid secara umum (Lee 2000); fase bergerak menggunakan metanol/air (50:50 v/v, pH 2.5 menggunakan asam asetat) dan laju aliran 1 mL/menit. Menurut Lee (2000), sejumlah kecil asam asetat (2-5%), asam fosfat, asam trifluoroasetat (0,1%) ditambahkan ke dalam pelarut untuk mencegah ionisasi komponen fenolik maupun karbosiklik, meningkatkan resolusi dan reprodusibilitas analisa. Kuantifikasi komponen flavonoid dilakukan dengan cara membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram standar yaitu katekin.
Analisis Statistik
Data yang diperoleh dianalis dengan analisa statistik menggunakan uji t- student perbandingan dua sampel pada taraf nyata 5% untuk melihat adanya pengaruh nyata konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak sebelum dan sesudah intervensi antara kelompok perlakukan dan kelompok kontrol. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program aplikasi statistik Minitab 14 for windows release.