Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama.
1. Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mendapatkan jenis gambir terbaik dalam menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans.
a. Pembuatan Media Streptococcus Selective Broth (SSB)
Media cair SSB dibuat dengan komposisi yang dapat dilihat pada Tabel 2, kemudian disuspensikan dalam 1 L akuades. SSB agar dibuat dengan mensuspensikan 30 gram media SSB dan 15 gram Bacto agar dalam 1 L akuades dan dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk, kemudian diukur pH-nya. pH akhir media sebesar 7.4±0.1. Setelah pH-nya memenuhi syarat, media disterilisasi dengan autoklaf 118ºC selama 15 menit.
Tabel 2. Komposisi Media SSB dalam g/L
Komposisi Kadar (g/L) Pepton kasein Pepton kedelai Natrium klorida Natrium sitrat L-Sistin Natrium sulfit Dekstrosa Natrium azida Kristal violet 15 5 4 1 0.2 0.2 5 0.2 0.0002
b. Regenerasi Streptococcus mutans
Sebelum digunakan dalam uji aktivitas antibakteri, Streptococcus mutans yang akan digunakan setiap kali harus diregenerasi. Pembuatan biakan agar miring dilakukan terlebih dahulu, yaitu dengan menggoreskan biakan dari stok bakteri ke beberapa agar miring yang masih baru. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Setelah 48 jam, biakan agar miring disimpan pada suhu 4-5°C. Biakan agar miring tersebut dapat dijadikan sebagai stok bakteri untuk menghindari terjadinya kontaminasi.
Dari stok bakteri tersebut, diambil satu mata ose dan diinokulasikan ke tabung reaksi yang berisi 5 mL media SSB steril. Selanjutnya tabung tersebut diinkubasi di dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 37°C.
c. Persiapan Sampel
Sebanyak 0.5 gram gambir dilarutkan dalam 100 ml air panas, kemudian didinginkan. Setelah dingin, larutan gambir tersebut akan digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri.
11
d. Uji Aktivitas Antibakteri (Pratten et al., 1998)
Sebanyak 4 ml biakan Streptococcus mutans yang telah disegarkan, diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril. Kemudian ditambahkan sampel dengan perbandingan 1:1, lalu divorteks selama 30 detik. Selanjutnya dibuat pengenceran hingga 10-6. Dari masing-masing pengenceran tersebut, diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri. Kemudian SSB agar dituangkan ke dalam cawan petri. Cawan tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C dan dihitung jumlah koloni Streptococcus mutans yang tumbuh pada SSB agar. Jumlah koloni awal Streptococcus mutans juga dihitung dengan cara yang sama, tetapi tanpa penambahan sampel.
% penghambatan = Nt – No x 100% No
dimana :
No = jumlah koloni awal
= jumlah koloni x 1
faktor pengenceran Nt = jumlah koloni setelah kontak dengan sampel
= jumlah koloni x 1 x 8 faktor pengenceran 4
2. Penelitian Utama
Pada penelitian utama dilakukan pembuatan obat kumur menggunakan gambir yang terbaik dalam menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Karakterisasi obat kumur gambir meliputi pengujian aktivitas antibakteri, stabilitas obat kumur, serta uji organoleptik. Oleh karena belum adanya standar untuk obat kumur, maka untuk menentukan konsentrasi gambir terbaik akan digunakan kontrol positif. Kontrol positif yang digunakan adalah obat kumur komersial tanpa alkohol, merek “Pepsodent Herbal Mouthwash”.
a. Pembuatan Obat Kumur Gambir (Sagarin dan Gershon, 1972)
Pada penelitian ini, pembuatan obat kumur gambir dilakukan dengan mencampurkan gambir yang telah dihaluskan, sakarin, peppermint oil dan air. Konsentrasi gambir yang dicampurkan pada obat kumur adalah 1%, 2%,
3%, 4%, dan 5% (b/v). Untuk mengurangi endapan yang terbentuk pada obat kumur gambir, maka dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring Whattman no. 42. Sampel obat kumur gambir tersebut kemudian dimasukkan ke dalam botol gelas, ditutup rapat dan disimpan pada suhu ruang.
b. Pengujian Aktivitas Antibakteri dalam Obat Kumur (Pratten et al., 1998)
Sebanyak 4 ml biakan Streptococcus mutans yang telah disegarkan, diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril. Kemudian ditambahkan sampel obat kumur dengan perbandingan 1:1, lalu divorteks selama 30 detik. Selanjutnya dibuat pengenceran hingga 10-6. Dari masing- masing pengenceran tersebut, diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri. Kemudian SSB agar dituangkan ke dalam cawan petri. Cawan tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C dan dihitung jumlah koloni Streptococcus mutans yang tumbuh pada SSB agar tersebut. Jumlah koloni awal Streptococcus mutans juga dihitung dengan cara yang sama, tetapi tanpa penambahan sampel obat kumur.
% penghambatan = Nt – No x 100% No
dimana :
No = jumlah koloni awal
= jumlah koloni x 1
faktor pengenceran
Nt = jumlah koloni setelah kontak dengan sampel obat kumur = jumlah koloni x 1 x 8
faktor pengenceran 4
c. Pengujian Stabilitas Obat Kumur Gambir
Pengujian stabilitas obat kumur gambir dilakukan pada minggu ke-0, minggu ke-1, minggu ke-2, minggu ke-3, dan minggu ke-4. Pengujian stabilitas obat kumur gambir meliputi pengukuran pH, pengukuran viskositas, dan pengujian mikrobiologis (total mikroba).
13
1) Pengukuran pH (Apriyantono, 1989)
Sebelum pengukuran, pH meter dikalibrasi menggunakan larutan Buffer standar pH 4 dan pH 7. Pengukuran dilakukan dengan cara elektroda dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas tissue. Kemudian elektroda dicelupkan pada larutan sampel dan dibiarkan beberapa saat sampai diperoleh pembacaan yang stabil, lalu nilai pH dicatat.
2) Pengukuran Viskositas
Viskositas sampel obat kumur diukur dengan menggunakan Brookfield viscometer. Sebelum pengukuran, alat diset dengan meratakan permukaan pada mata kucing yang terdapat pada alat. Selanjutnya sampel (100 ml) dicelupkan sampai batas spindel yang telah ditetapkan. Viskometer dinyalakan selama ±10 detik, kemudian ditetapkan ukuran dan alat dimatikan. Viskositas dihitung dengan mengkonversi nilai viskositas yang telah ditetapkan dengan skala pada spindel.
3) Pengujian Total Mikroba (Fardiaz, 1987)
Sebanyak 1 ml sampel obat kumur dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Untuk setiap sampel digunakan dua cawan (duplo). Kemudian media PCA steril yang telah didinginkan hingga suhunya 47- 50°C dituang ke dalam cawan sebanyak 10-15 ml dan digoyangkan secara mendatar di atas meja supaya sampel menyebar rata. Cawan berisi agar yang telah membeku diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30°C selama 48 jam. Total mikroba ditetapkan dengan SPC (Standard Plate Count). Cara penghitungan koloni dalam Standard Plate Count (SPC) adalah : (Rahayu et al, 2001)
• Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300
• Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni
• Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni
d. Uji Organoleptik (Soekarto, 1990)
Uji organoleptik merupakan uji dengan menggunakan indera manusia sebagai instrumennya. Uji organoleptik yang akan dilakukan adalah uji penerimaan dimana setiap panelis diharuskan mengemukakan tanggapan pribadinya terhadap produk yang disajikan. Tujuan dari uji penerimaan ini adalah untuk mengetahui apakah produk obat kumur gambir ini disukai. Uji penerimaan yang dilakukan adalah uji hedonik dengan menggunakan 30 panelis agak terlatih.
Pada uji ini, panelis diminta mengungkapkan tanggapan pribadinya terhadap warna, rasa dan aroma dari sampel obat kumur gambir yang diberikan. Tanggapan tersebut dapat berupa tanggapan suka ataupun ketidaksukaan. Skala hedonik yang digunakan adalah 1-7, dimana angka 1 = sangat tidak suka, 2 = tidak suka, 3 = agak tidak suka, 4 = netral, 5 = agak suka, 6 = suka, 7 = sangat suka. Data yang diperoleh, ditabulasikan dan dianalisis dengan analisis sidik ragam.
