Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah nutrien agar, alkohol 96 %, spirtus, media CMSC (Carbon Minimal Salts Culture), media Luria Bertani, logam berat (Fe, Zn, Pb dan Hg), minyak diesel, aquades, kertas saring, kapas, alumuniu m foil, garam fisiologis dan aquades.
Peralatan yang digunakan meliputi petridisk, tabung reaksi, tabung ulir, tabung serum, tabung film, tabung eppendorf, jarum ose, kertas pH, spektrofotometer, mikropipet berbagai ukuran, tip pipet berbagai ukuran, gelas ukur, gelas piala, labu erlenmeyer, lemari pendingin, inkubator, rotary shaking incubator, oven, autoclave, clean bench dan atomic absorption spectrophotometry (AAS).
Sumber mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroorganisme yang telah teridentifikasi hasil isolasi dari kotoran hewan, yaitu Pseudomonas pseudomallei dan Enterobacter agglomerans (Anggraeni, 2003).
B. METODOLOGI PENELITIAN 1. Penyegaran Isolat
Stok isolat dalam gliserol, disegarkan dalam tabung ulir yang berisi 4 ml media Luria Bertani (Tabel 6). Sebanyak 0.1 ml isolat diambil dengan menggunakan pipet mikro untuk ditumbuhkan pada media LB diinkubasikan pada suhu kamar selama 96 jam, dilihat kekeruhan yang terjadi. Jika pada tabung ulir tersebut terjadi kekeruhan, maka isolat tersebut mengalami pertumbuhan.
Tabel 6. Komposisi Media Luria Bertani
Bahan Kimia Komposis (g/L) Bacto Trypton Yeast Ekstrak NaCl Agar * 10 5 5 20
Nilai kekeruhan yang terjadi diukur dengan menggunakan spektrofotometer setiap 24 jam. Kemudian dihitung jumlah sel dengan metode total plate count (TPC).
2. Penambahan Logam Berat Dalam Berbagai Konsentrasi
Untuk mengetahui pengaruh logam berat terhadap pertumbuhan mikroorganisme dilakukan penambahan logam berat (Fe, Zn, Pb dan Hg) dalam media CMSC (Tabel 7) dengan penambahan minyak diesel 10% . Isolat murni Pseudomonas pseudomallei dan Enterobacter agglomerans serta kombinasi keduanya yang berasal dari biakan yang telah disegarkan, ditumbuhkan di dalam 20 ml media tersebut. Penambahan logam berat dalam berbagai konsentrasi dilakukan secara bertahap dalam interval tertentu.
Tabel 7. Komposisi Media CMSC
Bahan Kimia Komposisi (g/L) K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 NaCl MgSO4*) 2.2 0.73 1 30 0.2
*) Tambahkan setelah media selesai diautoklaf dan suhunya mencapai suhu ruang.
Kultur diinkubasikan pada suhu ruang dan digoyang dengan kecepatan 200 rpm. Setiap 24 jam, diambil sampel untuk melihat pertumbuhan selnya dengan metode turbidimetri menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm, pengukuran biomassa kering dan dilakukan juga pengukuran pH. Pengukuran dilakukan hingga jam ke 96 (hari ke 4). Dari hasil pengukuran secara turbidimetri tersebut, dilakukan penghitungan jumlah sel dengan metode Total Plate Count (TPC) (Lampiran 1), pada jam dimana nilai absorbansinya mencapai maksimal.
Sebagai pembanding, dilakukan pengukuran pertumbuhan isolat pada media minimal dengan 10 % minyak diesel tanpa penambahan logam berat. Pengukuran dilakukan dengan metode turbidimetri dan metode Plate Count.
4 ml Luria Bertani (LB) dalam tabung ulir
Sterilisasi pada temperatur 121oC selama 15 menit
Inokulasikan 1 lup isolat dalam 4 ml media LB
Inkubasi dalam rotary shaking incubator, 200 rpm, 28-32 oC
Isolat segar
Inkubasi pada rotary shaking inkubator, 28- 32 oC, 200 rpm, selama 96 jam
Isolat diamati setiap 24 jam (OD, pH, biomassa dan jumlah sel)
Gambar 1. Diagram Alir Penyegaran Isolat dan Pengaruh Logam Berat Terhadap Pertumbuhan Isolat
3. Pengaruh Interaksi Logam Antara Zn-Pb
Interaksi antara logam Zn-Pb, dilakukan dengan mengambil 10 titik awal sebagai titik acuan untuk mengetahui pengaruhnya terhadap pertumbuhan mikroorganisme (Gambar 2). Nilai-nilai tersebut diperoleh dari hasil penelitian pendahuluan tentang pengaruh masing- masing logam Zn dan Pb terhadap nilai optical density (OD) dan nilai total plate count (TPC). Respon yang diukur meliputi jumlah sel berdasarkan metode Total Plate Count (TPC), berat biomass kering dan pH.
Inokulasikan isolat dalam media CMSC 20 ml dengan penambahan logam berat
(J. 3414,3000) (I. 2000,5121) (H. 3000,4500) (D.1000,4500) (E. 2000,3000) (A. 586,3000) (C. 1000,1500) (B. 2000,879) (G. 3000,1500)
Gambar 2. Titik Uji Interaksi Logam Zn-Pb
Respon yang diperoleh kemudian akan diplotkan dalam bentuk grafik tiga dimensi dengan menggunakan software Statistica 6.0
4. Pola Akumulasi Logam Berat
Pola akumulasi digunakan untuk mengetahui distribusi logam dalam supernatan dan dalam biomass sel. Pengujian ini dilakukan dengan menghitung penurunan konsentrasi logam berat dalam supernatan dengan konsentrasi awal 100 ppm Zn dan 100 ppm Pb. Pengujian ini dilakukan pada saat nilai OD maksimum (jam ke 72) dengan melakukan sentrifugasi dingin pada kecepatan 13000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisahkan, untuk kemudian diukur konsentrasi logam beratnya dengan menggunakan metode atomic absorption spectrophotometry (AAS). Biomassa dalam tabung ependorf yang telah dipisahkan dengan supernatannya dimasukkan pada oven bersuhu 100 oC hingga diperoleh berat kering yang konstan.
1000 2000 3000 Pb (ppm) 1500 3000 4500 Zn (ppm)
Tabung serum berisi 20 ml media mineral steril + logam Zn 100 ppm dan Pb 100 ppm
Inokulasi dengan inokulum yang telah disegarkan
Inkubasi pada rotary shaking inkubator, 28-32 oC, 200 rpm, selama 96 jam
Sentrifugasi 13000 rpm pada jam ke 72, 15 menit
Supernatan dipisahkan, diukur konsentrasi logamnya dengan metode AAS
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. PEMELIHARAAN ISOLAT DAN DEGRADASI MINYAK DIESEL
Beberapa jenis mikroorgansime mempunyai toleransi yang tinggi terhadap logam dan mampu mengakumulasi logam berat melalui berbagai macam mekanisme (Nugroho, 2001). Beberapa macam mikroorganisme yang mempunyai toleransi terhadap logam antara lain Pseudomo nas, Bacillus, Acinetobacter, Flavobacterium dan Desulvovibrio.
Pseudomonas pseudomallei (PP), Pseudomonas aeruginosa (PA) dan Enterobacter agglomerans (EA) merupakan isolat hasil isolasi kotoran hewan yang mampu tumbuh pada konsentrasi 10% minyak diesel (Anggraeni, 2003). Menurut Hikmatulloh (2004), dibandingkan dengan isolat tunggalnya, kombinasi isolat Pseudomonas pseudomallei + Enterobacter agglomerans (PPEA) dan Pseudomonas aeruginosa + Enterobacter agglomerans (PAEA) lebih mampu mendegradasi hidrokarbon minyak diesel, sedangkan menurut Zaky (2005), degradasi hidrokarbon oleh isolat PPEA menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan isolat PAEA.
Penelitian ini melakukan pengujian pengaruh logam berat Hg, Pb, Zn dan Fe terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas pseudomallei, Enterobacter agglomerans dan kombinasi isolat Pseudomonas pseudomallei+Enterobacter agglomerans (PPEA) pada media CMSC (Carbon Minimal Salts Culture) dengan penambahan minyak diesel 10%.
Pemeliharaan isolat bakteri PP, EA dan PPEA dilakukan terhadap stok isolat yang disimpan di dalam tabung ependorf berisikan larutan gliserol pada suhu sekitar -40 oC. Isolat ditumbuhkan kembali pada media CMSC dengan penambahan 10% minyak diesel.
Pemeliharaan isolat bakteri dilakukan untuk meningkatkan kemampuan dan jumlah sel, sebelum dilakukan penambahan logam berat. Pengamatan dilakukan setiap hari terhadap kekeruhan yang terjadi dibandingkan kontrol. Terjadinya kekeruhan menunjukkan bahwa isolat tersebut mengalami pertumbuhan dan mampu memanfaatkan sumber karbon yang berasal dari minyak diesel, yang berarti mampu mendegradasi minyak diesel. Selanjutnya
dilakukan penghitungan jumlah sel dengan menggunakan metode Total Plate Count (TPC), pada saat nilai kekeruhan sel (optical density) mencapai puncaknya pada jam ke 72, dengan melakukan pengenceran hingga 10-1 3 secara aseptis.
Gambar 4. Grafik Pertumbuhan Bakteri PP, EA dan PPEA pada Konsentrasi 10 % Minyak Diesel
Berdasarkan grafik diatas, ketiga isolat mampu tumbuh dalam media yang telah ditambahkan 10% minyak diesel sebagai sumber karbon. Hal tersebut disebabkan karena bakteri mempunyai kemampuan untuk meningkatkan kontak dengan minyak melalui mekanisme adhesi atau adsorpsi, yaitu meningkatkan interaksi antara permukaan membran luar sel yang bersifat hidrophobik dengan minyak. Setelah mengadhesi permukaan minyak, bakteri melakukan pembelahan sel. Ketika permukaan minyak menjadi jenuh oleh bakteri, maka pertumbuhan bakteri dibatasi oleh ketersediaan minyak. Jika bakteri mampu memisahkan lapisan butiran minyak (emulsifikasi), maka permukaan untuk pertumbuhan sel akan terbentuk (Rosenberg dan Ron, 1998). Berdasarkan penghitungan jumlah sel, isolat Pseudomonas pseudomallei (PP) mampu tumbuh hingga 1012 cfu/ml, Enterobacter agglomerans (EA) mampu tumbuh hingga 101 2 cfu/ml dankombinasi isolat Pseudomonas pseudomallei+Enterobacter agglomerans (PPEA) mampu tumbuh hingga 1013 cfu/ml (data disajikan pada Lampiran 2).
Kehadiran senyawa -senyawa toksik dalam minyak diesel seperti hidrokarbon rantai pendek (Citroreksoko, 1996) dan BTEX (benzen, toluen, etilbenzen, xilen) (Rosenberg dan Ron, 1998) mengakibatkan isolat
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 1 2 3 4 Hari ke OD 600 nm PP EA PPEA
membutuhkan waktu relatif lama untuk bisa beradaptasi dengan kondisi lingkungan di sekitarnya. Menurut Oetomo (1997), untuk bisa beradaptasi dengan kondisi lingkungannya, mikroorganisme memerlukan waktu untuk: (1) pertumbuhan awal populasi yang mendegradasi sampai menjadi ukuran yang cukup besar untuk mempengaruhi degradasi; (2) aktivitas enzim mikrobial yang dibutuhkan; (3) perubahan gene tik dalam populasi yang mendegradasi; dan (4) penggunaan substrat pengganti oleh mikroorganisme yang mendegradasi.
Gambar 5. Foto Pertumbuhan (1) PPEA (2) PP (3) (EA) pada Media CMSC dengan Penambahan 10% Minyak Diesel.
Pengamatan secara visual dilakukan selama satu minggu telah menunjukkan adanya perubahan pada media yang semakin lama berubah menjadi keruh (data disajikan pada Lampiran 2a). Minyak diesel yang semula menyatu dan membentuk lapisan tersendiri pada permukaan media akan terpecah menjadi butiran-butiran seperti gelembung dalam jumlah yang cukup banyak. Terbentuknya butiran-butiran minyak tersebut disebabkan oleh produksi biosurfaktan oleh bakteri. Menurut Karanth et al. (2005) beberapa bakteri yang mampu menghasilkan biosurfaktan untuk mengemulsi substrat hidrokarbon antara lain rhamnolipid yang diproduksi oleh Pseudomonas sp. dan trehalose nonionik yang diproduksi oleh Enterobacter sp. Biosurfaktan dapat melarutkan senyawa hidrophobik pada struktur sel yang dapat meningkatkan daya larut antara minyak dan media, sehingga akan menurunkan tegangan permukaan pada minyak.
Berdasarkan pengamatan selama proses degradasi, tercium bau asam ketika tabung serum tersebut dibuka (data disajikan pada Lampiran 2b). Hal ini menunjukkan bahwa terjadi pembentukan asam-asam lemak, CH4, CO2 dan H2O sebagai hasil biodegradasi minyak diesel. Pembentukan gas CO2 dihasilkan melalui proses aerobik yang dilakukan oleh bakteri aerob yaitu Pseudomonas pseudomallei. Menurut Cookson (1995), Enterobacter agglomerans merupakan bakteri anaerobik fakultatif yang dalam kondisi aerob akan mempergunakan asam asetat sebagai sustratnya untuk menghasilkan gas CH4.
Pada degradasi minyak diesel yang 90% komponennya tersusun atas hidrokarbon, maka enzim yang berperan adalah enzim-enzim oksigenase. Monooksigenase berperan dalam degradasi hidrokarbon alifatik, sedangkan dioksigenase pada hidrokarbon asiklik. Pada n-alkana insersi molekul oksigen ke dalam struktur hidrokarbon terjadi pada gugus metil terminal maupun subterminal. N-alkana dioksigenasi menjadi alkohol kemudian menjadi asam karboksilat, yang selanjutnya akan dilakukan pemisahan dua unit karbon secara berkesinambungan dan dikenal dengan sekuen beta oksidasi (Cookson, 1995). Rantai panjang dari asam lemak akan dikonversi oleh acyl coenzyme A membentuk asetil-CoA dan rantai pendek asam lemak yang telah berkurang dua unit gugus karbonnya sebagai CO2 melaui siklus tricarboxylic acid (TCA) secara berulang-ulang (Atlas dan Bartha, 1998; Bailey dan Ollis, 1988).
B. PENGARUH LOGAM BERAT PADA PERTUMBUHAN BAKTERI
Pada umumnya logam berat akan memberikan efek toksik terhadap semua jenis mahluk hidup termasuk mikroorganisme. Beberapa mikroorganisme tidak mengalami gangguan pertumbuhan pada rentang konsentrasi tertentu. Penambahan logam berat ke dalam ekosistem dalam jumlah banyak akan menimbulkan tekanan terhadap mikroorganisme yang hidup dalam ekosistem tersebut. Sebagai akibatnya sebagian mikroorganisme akan mati dan sebagian membuat penyesuaian dan terjadilah seleksi alamiah.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 1 2 3 4
Waktu (hari ke)
OD 600 nm 200 ppm 150 ppm 100 ppm 50 ppm 20 ppm 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4
Waktu (hari ke)
OD 600 nm 8000 ppm 5000 ppm 3000 ppm 2000 ppm 1000 ppm 500 ppm 100 ppm 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4
Waktu (hari ke)
OD 600 nm 8000 ppm 6000 ppm 4000 ppm 2000 ppm 1000 ppm 500 ppm 100 ppm
Gambar 6. Grafik Pertumbuhan PPEA pada Berbagai Konsentrasi Logam (a) Zn, (b) Pb, (c) Fe dan (d) Hg dengan Penambahan 10% Minyak Diesel. a. Zn b. Pb c. Fe d. Hg 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4
Waktu (hari ke)
OD 600 nm 8000 ppm 6000 ppm 4000 ppm 2000 ppm 1000 ppm 500 ppm 100 ppm
1. Pengaruh Logam Berat Seng (Zn)
Berdasarkan Gambar 6a, pada konsentrasi 100 ppm Zn kombinasi PPEA memiliki tingkat kekeruhan tertinggi sebesar 0.410 dengan jumlah sel mencapai 9.8x1010 cfu/ml, isolat tunggal PP memiliki tingkat kekeruhan 0.400 dengan jumlah sel mencapai 4.6 x 1010 cfu/ml dan EA memiliki tingkat kekeruhan 0.380 dengan jumlah sel mencapai 3.1 x 1010 cfu/ml (data disajikan pada Lampiran 3). Hal tersebut menunjukkan bahwa kedua isolat mampu tumbuh dan mempunyai toleransi terhadap kehadiran logam Zn.
Dibandingkan dengan kontrol, pada konsentrasi antara 1000 ppm hingga 2000 ppm, pertumbuhan kedua isolat ini hanya mencapai 50 % dibandingkan dengan kontrol. Rata-rata jumlah sel yang mampu tumbuh hanya sebesar 106 - 107 cfu/ml. Pada konsentrasi Zn 4000 ppm, pertumbuhan kedua isolat mengalami penghambatan secara signifikan dengan jumlah sel turun mencapai 5.6x105 cfu/ml untuk PP, 5.0x105 cfu/ml untuk EA dan 6.7 x 105 cfu/ml untuk kombinasi PPEA. Menurut Trindade et al. (2004), jumlah sel optimum dalam melakukan degradasi minyak bumi sebesar 108 cfu/ml dan jumlah sel sebesar 106 cfu/ml, masih memungkinkan untuk mendegradasi senyawa hidrokarbon.
Umumnya pertumbuhan mikroorganisme akan terhambat dengan kenaikan konsentrasi logam. Pada konsentrasi Zn diatas 4000 ppm yang ditambahkan ke dalam media, kedua isolat mengalami penghambatan pertumbuhan dengan jumlah sel kurang dar 106 cfu/ml, bahkan tidak mampu tumbuh sama sekali pada konsentrasi 10000 ppm Zn.
Menurut Rajapaksha et al. (2004), pada konsentrasi 8300 ppm Zn, dapat menurunkan aktivitas komunitas bakteri tanah hingga mencapai kurang dari 10% dibandingkan dengan kontrol. Pseudomonas aeroginosa akan terhambat pertumbuhannya pada saat konsentrasi antara 1800 ppm hingga 3200 ppm Zn (Teitzel dan Parsek, 2003). Pertumbuhan spesifik maksimum cenderung menurun dengan kenaikan konsentrasi logam yang ditambahkan. Semakin tinggi konsentrasi logam berat yang ditambahkan, semakin menurun kemampuan mikroorganisme untuk melakukan pertumbuhannya (data disajikan pada Tabel 8). Logam Zn dapat menyebabkan kerusakan sel yang
serius karena mempunyai afinitas yang tinggi dengan gugus fosfat seperti ADP dan ATP (Roane dan Pepper, 2000).
Tabel 8. Kinetika Pertumbuhan PPEA Pada Logam Zn
Konsentrasi Zn (ppm) Parameter
100 500 1000 2000 4000 6000 8000 X maks. (mg/ml) 7.8 7.1 6.0 5.4 5.0 4.3 3.3
µx-maks (hari-1) 0.589 0.563 0.458 0.426 0.411 0.292 0.159
2. Pengaruh Logam Berat Timbal (Pb)
Gambar 6b menunjukkan bahwa kombinasi isolat PPEA mampu tumbuh dan mempunyai toleransi terhadap kehadiran logam Pb. Pada konsentrasi 100 ppm Pb, PPEA memiliki tingkat kekeruhan tertinggi sebesar 0.450 dengan jumlah sel mencapai 8.1x1010 cfu/ml. Sedangkan PP memiliki tingkat kekeruhan 0.430 dengan jumlah sel mencapai 6.8 x 1010 cfu/ml dan EA memiliki tingkat kekeruhan 0.410 dengan jumlah sel mencapai 5.6 x 101 0 cfu/ml (data disajikan pada Lampiran 4).
Pertumbuhan kedua isolat ini hanya mencapai 50 % pada konsentrasi antara 1000 ppm hingga 3000 ppm, dibandingkan dengan kontrol. Rata-rata jumlah sel yang mampu tumbuh hanya sebesar 106 - 107 cfu/ml. Pada konsentrasi Pb 5000 ppm, pertumbuhan kedua isolat mengalami penghambatan secara signifikan dengan jumlah sel turun mencapai 4.3 x 105 cfu/ml untuk PP, 5.0 x 105 sel/ml untuk EA dan 7.4 x 105 cfu/ml untuk kombinasi PPEA. Pertumbuhan mikroorganisme akan terhambat dengan kenaikan konsentrasi logam.
Pada konsentrasi diatas 8000 ppm Pb, kedua isolat tidak lagi mengalami pertumbuhan. Penambahan logam berat hingga konsentrasi tinggi mampu membunuh sel hidup karena efek toksik dari logam yang ditambahkan, sehingga dapat menurunkan kemampuan sel untuk berkembang biak.
Tabel 9. Kinetika Pertumbuhan PPEA Pada Logam Pb
Konsentrasi Pb (ppm)
Parameter 100 500 1000 2000 3000 5000 8000 X maks. (mg/ml) 5.6 5.6 5.1 4.8 4.6 4.0 3.2
µx-maks (hari- 1) 0.445 0.467 0.444 0.367 0.304 0.255 0.165
Menurut Teitzel dan Parsek (2003), Pseudomonas aeroginosa akan terhambat pertumbuhan saat konsentrasi Pb mencapai 3100 ppm. Shi et al. (2002) telah mengisolasi sejumlah mikroorganisme yang berasal dari tanah terkontaminasi logam Cr, Pb dan hidrokarbon. Pada konsentrasi 400 ppm Pb, dapat menyebabkan turunnya aktivitas bakteri tersebut hingga mencapai 50 %. Logam Pb dapat menyebabkan toksik pada mikroorganisme, karena mampu menempati ion-ion logam esensial yang digunakan untuk metabolisme sel. Logam Pb dapat berikatan dengan gugus sulfidril (-SH), dan mengakibatkan kerusakan pada protein (Wong et al., 2002).
3. Pengaruh Logam Besi (Fe)
Berdasarkan Gambar 6c diatas, kombinasi isolat PPEA mampu tumbuh dan mempunyai toleransi yang lebih baik terhadap kehadiran logam Fe dibandingkan terhadap logam Zn dan logam Pb. Menurut Kementerian Negara Lingkungan Hidup, logam Fe termasuk dalam kategori logam yang bersifat toksik rendah. Pada konsentrasi 100 ppm Fe, kombinasi PPEA memiliki tingkat kekeruhan tertinggi sebesar 0.460 dengan jumlah sel mencapai 4.1x101 1 cfu/ml dibandingkan dengan isolat tunggalnya. Sedangkan PP memiliki tingkat kekeruhan 0.420 dengan jumlah sel mencapai 8.3 x 101 0 cfu/ml dan EA memiliki tingkat kekeruhan 0.430 dengan jumlah sel mencapai 9.6 x 1010 cfu/ml (data disajikan pada Lampiran 5).
Dibandingkan dengan kontrol, pertumbuhan kedua isolat ini turun hingga 50 % pada konsentrasi antara 2000 ppm hingga 4000 ppm. Rata-rata jumlah sel yang mampu tumbuh hanya sebesar 106 - 107 cfu/ml. Pada konsentrasi Fe
6000 ppm, pertumbuhan kedua isolat mengalami penghambatan secara dengan jumlah sel turun mencapai 8.3 x 104 cfu/ml untuk PP, 9.0 x 104 cfu/ml untuk EA dan 3.4 x 105 cfu/ml untuk kombinasi PPEA.
Konsentrasi maksimum hingga kedua isolat tersebut tidak mampu tumbuh dicapai pada 10000 ppm Fe. Menurut Dopson et al. (2003), Acidimicrobium ferrooxidans akan mengalami lisis ketika ditambahkan logam Fe sebesar 20000 ppm, sedangkan L. ferrooxidans dan Acidimicrobium cryptum tahan terhadap logam Fe hingga konsentrasi 28000 ppm. Pengujian ini dilakukan dengan penambahan besi (II) atau Fe2+ sebagai ion yang dapat larut dan umum ditemukan dalam air tanah dibandingkan dengan besi (III).
Tabel 10. Kinetika Pertumbuhan PPEA Pada Logam Fe
Konsentrasi Fe (ppm) Parameter
100 200 1000 2000 4000 6000 8000 X maks. (mg/ml) 7.9 7.3 6.2 5.6 5.1 4.6 3.4
µx-maks (hari- 1) 0.639 0.556 0.454 0.467 0.376 0.346 0.153
Menurut Brock dan Madigan (1991), Fe2+ akan dioksidasi menjadi Fe3+ dan digunakan oleh bakteri dalam menghasilkan energi. Bakteri mengkonsumsi O2, H+ dan Fe2+ untuk menghasilkan Fe3+ dan H2O berdasarkan reaksi berikut ini
2 Fe2+ 2 Fe3+ + 2e 2e + 0.5 O2 + 2H+ H2O
2 Fe2+ + 0.5 O2 + 2H+ 2 Fe3+ + H2O
Menurut Ford dan Mitchell (1992), Fe3+ dapat diakumulasi oleh bakteri yang mempunyai komponen organik yang disebut dengan siderophorus. Siderophorus terdiri dari gugus hidroksil (-OH) yang berasosiasi dengan molekul nitrogen dan mempunyai afinitas tinggi terhadap kehadiran Fe3 +
dengan membentuk pengkelat. Pseudomonas sp. merupakan salah satu bakteri yang memiliki siderophorus.
Logam besi (Fe) diperlukan untuk mela kukan proses metabolisme dalam konsentrasi yang rendah. Besi (Fe) diperlukan juga dalam proses oksidasi bahan organik dalam media mikroorganisme anaerob untuk menghasilkan energi (Saeni, 1989).
4. Pengaruh Logam Merkuri (Hg)
Logam Hg termasuk logam berat dengan tingkat toksisitas tinggi. Tingkat bahaya Hg yang tinggi dapat diketahui dari banyaknya korban pada penduduk di teluk Minamata yang mengkonsumsi ikan tercemar merkuri.
Berdasarkan Gambar 6d, logam Hg merupakan logam yang paling toksik terhadap pertumbuhan kombinasi isolat PPEA. Pada konsentrasi antara 20 ppm hingga 50 ppm Hg, kombinasi PPEA hanya memiliki tingkat kekeruhan sebesar 0.280 hingga 0.300, dengan jumlah sel antara 107 - 108 cfu/ml. Sedangkan PP memiliki tingkat kekeruhan sekitar 0.260 hingga 0.280, dengan jumlah sel 107 - 108 cfu/ml dan EA memiliki tingkat kekeruhan 0.270 hingga 0.280, dengan jumlah sel mencapai 106-107 cfu/ml (data disajikan pada Lampiran 6). Dibandingkan dengan kontrol, pertumbuhan kedua isolat ini mengalami penur unan.
Pada konsentrasi Hg 100 ppm, pertumbuhan kedua isolat mengalami penghambatan secara signifikan dengan jumlah sel turun mencapai 6.3 x 104 cfu/ml untuk PP, 3.4 x 105 cfu/ml untuk EA dan 7.2 x 105 cfu/ml untuk kombinasi PPEA. Konsentrasi Hg 150 ppm, isolat PP, EA dan kombinasi isolat PPEA hanya mampu tumbuh sebesar 101-102 cfu/ml.
Menurut Canstein et al. (1999), Pseudomonas putida mempunyai toleransi terhadap logam Hg hingga konsentrasi 9 ppm. Diatas konsentrasi tersebut, Pseudomonas putida akan mengalami penghambatan pertumbuhan, sedangkan menurut Dopson et al. (2003), Acidimicrobium Ferrooxidans, S. metallicus dan Xanthomonas maltophilis adalah sebagian mikroorganisme yang mampu hidup pada media yang mengandung Hg. Handayani (2001), melakukan penelit ian tentang bakteri Pseudomonas sp. yang mampu
0 0.2 0.4 0.6 0.8 2 2.4 2.8 3.2 3.4 3.6 3.8 Log Konsentrasi (ppm) U-maks Zn Pb Fe
mereduksi logam Hg sebesar 94.7% hingga 97.8% pada konsentrasi logam Hg awal sebesar 120 ppm.
Tabel 11. Kinetika Pertumbuhan PPEA Pada Logam Hg
Bakteri yang toleran terhadap Hg merupakan akseptor elektron dan dapat memanfaatkan merkuri dalam metabolisme. Bakteri resisten Hg menghasilkan enzim lyase organomerkuri yang dapat memutuskan ikatan C-Hg dan enzim merkuri reduktase yang mereduksi Hg2+ yang bersifat toksik menjadi Hg0 yang bersifat lebih tidak toksik dan volatil (Gadd, 1990). Hg mudah membentuk ikatan kovalen dengan sulfur. Apabila sulfur terdapat dalam bentuk sulfidril (-SH), maka Hg divalen menggantikan ion hidrogen membentuk merkaptida (Hg-SR). Akibatnya aktivitas gugus sulfidril pada pembentukan protein terhambat, sehingga metabolisme dan fungsi sel terganggu.
Gambar 7. Grafik Penurunan Nila i ì -maks pada Kenaikan Konsentrasi Logam Zn, Pb, Fe dan Hg. Konsentrasi Hg (ppm) Parameter 20 50 100 150 200 X maks. (mg/ml) 4.8 4.5 3.4 2.0 1.4 µx-maks (hari- 1) 0.413 0.381 0.291 0.077 0.026 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 40 80 120 140 Konsentrasi Hg (ppm) u-maks
10 8 6 4 2 0 10 8 6 4 2 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Zn 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 Pb