Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 11 bulan, bulan Agustus 2007 sampai bulan Juni 2008. Tempat penelitian di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Laboratorium Pemeriksaan Doping dan Kesehatan Masyarakat Daerah Provinsi DKI Jakarta.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan di dalam penelitian ini adalah sebagai berikut; alat-alat gelas, petridish, pipet mikro, autoklaf (ISO LAB, Jerman), laminar
(ESCO, Singapura), inkubator (Memmert, Jerman), pemanas (gerhardt Jerman), neraca analitik (Ohaus Ga200, Jerman), rotavapor, Multi shaker (EYELA, Jepang), freeze-dryer, termometer, plat aluminium Kromatografi Lapis Tipis (KLT) terdiri dari Merck silika gel 60 GF 254, KLT preparatif lempeng kaca silika gel 60 GF 254, rangkaian kolom kromatografi, lampu UV 254 nm, Instrumen GC-MS Agilent Technologies 6890 Gas Chromatograph with Auto Sampler and 5973 Mass Selective Detector and Chemstation data system.
Bahan-bahan yang digunakan adalah sarang lebah Trigona spp asal Pandeglang, isolat bakteri terdiri dari bakteri patogen yaitu E. coli, Salmonella sp, Klebsiella sp. dan Campylobacter sp. bakteri-bakteri non patogen yaitu Bachteriodes sp. Lactobacillus casei, Bifidobacteria bifidum yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Ilmu Pangan FATETA Institut Pertanian Bogor, media tumbuh bakteri yaitu : pepton, bakto agar, yeast ekstrak, glukosa, laktosa, Campylobacter Agar Base (DIFCO), dan suplemen Campylobacter. Pelarut berupa etanol 70%, propilen glikol, n-heksan, kloroform, dan etanol 90%. Pereaksi-pereaksi yakni Dragendrof, Lieberman, Burchard, Wagner, Mayer, daun pepaya, kuning telur, HCl, NH4OH, KMnO4, FeCl3, H2SO4 pekat, Silika gel G60 F254 (Merck) untuk KLT, dan silika gel G60 (0,063 – 0,200 mm) untuk KLT preparatif dan kromatografi kolom (70 – 230 mesh ASTM) (Merck).
Metode Penelitian Pengambilan Sampel
Sarang lebah Trigona spp diambil di beberapa lokasi pembudidayaan di desa Cibaliung kabupaten Pandeglang provinsi Banten, pada bulan Juli tahun 2007 (Lampiran 2). Desa Cibaliung khususnya maupun Kabupaten Pandeglang umumnya terletak pada koordinat : 60 21' - 70 10' LS dan 1040 48'- 1060 11' BT. Topografi sebagian besar wilayah daerah ini berupa dataran rendah dan dataran bergelombang. Kawasan selatan terdapat rangkaian pegunungan. Wilayahnya juga mencakup Pulau Panaitan (di sebelah barat, dipisahkan dengan Selat Panaitan), serta sejumlah pulau-pulau kecil di Samudera Hindia, termasuk Pulau Deli dan
Ekstraksi Propolis Trigona spp
Eskstraksi propolis dari sarang lebah Trigona spp ini dilakukan dengan metode Hasan (2006). Sebanyak 150 gr sarang lebah Trigona spp, dimaserasi dengan 650 ml etanol 70% (direndam sambil digojog dengan menggunakan shaker) selama 7 hari di dalam wadah erlenmeyer 1000 ml. Setelah 7 hari, filtrat didekantasi kemudian residu dimaserasi lagi dengan 50 ml etanol 70% yang baru. Proses ini dilakukan secara berulang setiap hari selama tujuh hari, hingga pelarut etanol pada residu tampak bening. Dengan demikian, total pelarut (etanol) yang digunakan adalah sebanyak 1000 ml, dan total waktu maserasi selama 14 hari. Filtrat yang diperoleh, disatukan di dalam wadah gelap, kemudian dikeringbekukan (freeze-dried) hingga membentuk ekstrak padat yang kemudian digunakan untuk pengujian selanjutnya.
Uji Aktivitas Antibakteri dan Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM).
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode perforasi atau difusi sumur (Andrews, 2001). Sampel untuk uji aktivitas antibakteri adalah larutan propolis yang dibuat sebanyak enam seri konsentrasi. Untuk kontrol positif digunakan larutan ampicilin 100 ppm, sedangkan kontrol negatif digunakan pelarut propilen glikol dan etanol 1%. Digunakan pula propolis x sebagai pembanding.
Penyiapan larutan propolis. Ekstrak propolis hasil freeze-drying dilarutkan dengan propilen glikol dalam perbandingan 1 : 5 (b/b), sehingga diperoleh larutan propolis dengan kadar 16,67%. Dari larutan dengan kadar 16,67% ini kemudian diencerkan dengan aquadest sehingga dihasilkan tujuh seri konsentrasi, yakni 16,67%, 8,33%, 4,17%, 2,08%, 1,04%, 0,52%, dan 0,26% (Lampiran 4)
Penyiapan larutan Ampicilin. Dibuat larutan antibiotik standar dari ampicilin dengan kadar 100 ppm sebagai kontrol positif (Lampiran 5)
Preparasi inokulum. Isolat bakteri dibiakkan dalam media cair PYG (peptone + yeast ekstrak + glukosa ; Lampiran 6), dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Biakan segar diukur densitas optik (OD ; optical density)-nya. Jika OD > 0,5, untuk inokulasi diambil 50 l. Jika OD > 0,5, maka diambil 100 l. Larutan inokulum yang sama dengan standar McFarland (Lampiran 8), kerapatan bakterinya sekitar 10o cfu/ml.
Uji KHTM (metode sumur difusi). Sebanyak 50 l bakteri hasil inokulasi pada media cair dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan dengan 10 ml larutan media agar steril 50oC (yang belum memadat). Campuran di dalam cawan petri dihomogenkan dengan cara menggoyang cawan petri secara perlahan-lahan membentuk angka delapan pada permukaan meja laminar. Campuran didiamkan hingga memadat kemudian dibuat lubang (sumur) berdiameter kira-kira 5 mm dengan menggunakan pipet tetes. Ke dalam setiap sumur dimasukkan 50 l larutan ekstrak propolis untuk tiap konsentrasi dan juga pembanding serta kontrol (positif maupun negatif) pada sumur-sumur yang lain. Dilakukan secara triplo (Gambar 7). Cawan ditutup rapat dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Setelah 24 jam inkubasi, diamati dan diukur daerah bening di sekitar sumur yang menunjukkan kemampuan penghambatan pertumbuhan bakteri (petunjuk aktivitas antibakteri). Pengukuran areal zona bening dilakukan dengan menggunakan jangka sorong.
16,67% 0,26%
8,33% 4,17% p.komersial p.glikol
2,08% Ampicilin
1,04% 0,52% etanol 1%
Gambar 9. Satu seri uji KHTM bakteri
Uji KHTM kertas cakram untuk bakteri Campylobacter. Bakteri Campylobacter mempunyai sifat sensitif terhadap oksigen dan hanya mampu
bertahan hidup selama 3 menit di dalam kondisi aerob. Uji KHTM terhadap bakteri ini memiliki dilakukan dengan menggunakan kertas cakram (Lampiran 7). Koloni Campylobacter diambil dengan jarum ose, dicampur dengan larutan fisiologis, dan diencerkan sampai kerapatan bakteri 106 cfu/ml (setara dengan standar McFarland 0,5, Lampiran 8). Inokulum bakteri uji disegarkan sehari sebelum pengujian. Media Campylobacter agar base steril sebelum memadat (55
o
C) dituang ke dalam cawan yang mengandung bakteri uji. Cawan digoyang agar campuran homogen, dan dibiarkan memadat. Kertas cakram steril (diameter 6 mm) diletakkan di atas media padat, kemudian diberi 15 l larutan uji. Cawan dimasukkan ke dalam anaerobic jar dengan penambahan CO2 10% dan nitrogen, dan diinkubasi pada suhu 42 oC selama 24 jam.
Analisis Fitokimia Propolis (Metode Harborne, 1996).
Analisis fitokimia propolis bertujuan untuk mengetahui secara kualitatif golongan senyawa-senyawa aktif di dalam ekstrak propolis. Identifikasi yang dilakukan meliputi uji terpenoid, uji alkaloid dan uji flavonoid.
Uji terpenoid dan steroid. Sampel ekstrak propolis dilarutkan dalam etanol 70% dengan perbandingan 1 : 10 (b/b) dan dipanaskan pada penangas air. Filtrat diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi Lieberman Burchard (terbuat dari 3 tetes asam asetat anhidrat + 1 tetes asam sulfat pekat). Terbentuknya warna hijau atau biru menunjukkan adanya steroid, dan warna merah atau ungu menunjukkan adanya senyawa terpenoid. Sebagai pembanding digunakan kuning telur .
Uji Alkaloid.Sampel ekstrak propolis dilarutkan dalam kloroform dengan perbandingan 1 : 2 (b/b) dan ditambah 5 tetes amonia. Fraksi kloroform diasamkan dengan asam sulfat. Bagian asamnya diambil dan ditambahkan masing-masing dengan pereaksi Dragendrof, Mayer, dan Wagner. Adanya alkaloid, ditandai sebagai berikut : dengan pereaksi Dragendrof terbentuk endapan merah. Dengan pereaksi Mayer terbentuk endapan putih. Dengan pereaksi Wagner terbentuk endapan coklat. Sebagai pembanding, digunakan air rebusan daun pepaya.
Uji Flavonoid dan senyawa fenolik. Sampel ekstrak propolis dilarutkan dengan metanol dengan perbandingan 1 : 2 (b/b), lalu dipanaskan pada suhu 50oC.
Disiapkan dua filtrat, yang masing-masing ditambah dengan larutan NaOH dan H2SO4 pekat. Warna jingga yang terbentuk akibat penambahan NaOH, menunjukkan adanya senyawa fenol hidrokuinon, sedangkan warna merah akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Pembanding yang digunakan adalah ekstrak buah pinang segar.
Penelusuran Senyawa Aktif di Dalam Propolis (Metode KLT).
Identifikasi fraksi senyawa. Analisis fraksi senyawa di dalam sampel propolis Trigona sppdilakukan dengan Kromatografi lapis tipis (KLT) dan juga KLT preparatif. Plat KLT silika gel G60 F254 sebagai fase diam sedangkan fasa gerak adalah campuran pelarut n-heksan : kloroform : etanol 90% dengan perbandingan 2 :1 : 0,1 (v/v). Jenis-jenis pelarut yang digunakan sebagai campuran eluen, diidentifikasi terlebih dahulu melalui uji eluen tunggal. Hasil KLT diamati dengan lampu uv 254 nm (Lampiran 13 dan Lampiran 14).
Fraksinasi. Pemisahan serta pemurnian tiap fraksi (fraksinasi) dilakukan dengan kromatografi kolom. Kolom kromatografi diisi dengan koloid silika gel GF254. Pelarut yang digunakan, baik untuk melarutkan ekstrak propolis sampel, pembuatan koloid silika gel G60 F254 untuk pengisian kolom, maupun sebagai eluen, adalah campuran pelarut n-heksan : kloroform : etanol 90%, 2 :1 : 0,1 (v/v).
Sebanyak 2 gram ekstrak propolis dilarutkan dengan 5 ml pelarut campuran (eluen), kemudian dimasukkan pada permukaan atas kolom. Secara perlahan, eluen ditambahkan dari permukaan atas kolom, sementara fraksi-fraksi ditampung setiap 5 ml pada ujung bawah kolom dengan laju alir 2 ml/menit. Larutan fraksi yang diperoleh, kemudian dianalisis dengan pelat KLT dan diamati dengan lampu uv 254 nm. Spot-spot yang sama, dikelompokkan untuk menghasilkan kelompok-kelompok fraksi.
Uji aktivitas fraksi senyawa terhadap aktivitas bakteri. Masing-masing kelompok fraksi senyawa dari hasil fraksinasi diuji aktivitas antibakterinya terhadap bakteri E. col, dengan metode difusi sumur.
Identifikasi Senyawa Fraksi Aktif. Kelompok fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar diisolasi dan diidentifikasi jenisnya dengan metode
gas chromatography – mass spectrometry (GC-MS). Digunakan instrumen GC-MS Agilen Technologies 6890 Gas Chromatograph dengan auto sample dan detektor selektif massa 5973 dan sistem data Chemstation. Kolom yang digunakan adalah kolom kapiler HP ultra 2, (17 m x 0,25 mm), dan diameter 0,25 l. Sebanyak 5 l sampel (fraksi C) diinjeksikan pada suhu 250 oC. Gas pembawa adalah helium, dengan sistem laju alir konstan, sebesar 0,9 l/menit.
Analisis Data.
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok dua faktor, yaitu taraf konsentrasi propolis dan jenis bakteri uji. Data hasil yang diolah adalah luas zona bening (mm) hasil uji KHTM, yang dianalisis dengan analisa varian (ANOVA) menggunakan bantuan program SPSS 15 dengan faktor pengaruh perbedaan jenis bakteri (patogen, nonpatogen) dan konsentrasi ekstrak propolis, terhadap pertumbuhan bakteri. Jika keragamannya nyata, maka digunakan uji BNJ (Beda Nyata Jujur / Tukey) untuk mengetahui tingkat perbedaan antar perlakuan. Untuk uji daya hambat fraksi-fraksi propolis terhadap aktifitas pertumbuhan bakteri E.coli, juga dianalisis varian (ANOVA) dengan bantuan program SPSS 15. Diagram alur penelitian pada Lampiran 1.
BAB IV
