PUTIH JANTAN GALUR WISTAR
METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan: daun gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F), tikus putih jantan galur wistar, Etanol 70% (teknis), Aquades, Furosemid (PT. IFARS), Polyvinil Pirolidon (PVP) (E-Merck).
B. Alat: toples kaca, evaporator, timbangan hewan uji (Ohaus) kepekaan 0,1gram, timbangan analitik (Satorius) kepekaan 0,1mg dan 0,01mg, jarum oral tikus ukuran 15, metabolic cage, alat-alat gelas (pyrex).
C. Jalannya Penelitian 1. Determinasi tanaman
Kebenaran dan deskripsi morfologi daun gandarusa di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO2T) Tawangmangu, dengan menggunakan buku Flora of Java (Backer and Van den Brink, 1965), buku Flora (Van Steenis, 2003) dan buku Taksonomi Tumbuhan Spermatophyta (Tjitrosoepomo, 1988).
bulan Februari 2008. 3. Pemilihan Hewan Uji
hewan uji yang digunakan disini adalah tikus putih jantan galur wistar, umur 2-3 bulan, dengan berat 130-200 gram sebanyak 25 ekor.
4. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Gandarusa (Justicia gendarussa Burm.F): ekstrak etanol daun gandarusa dibuat dengan cara maserasi. Maserasi dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia daun gandarusa (300 g) dengan derajat halus yang cocok dimasukkan dalam toples kaca , kemudian dituangi dengan 75 bagian pelarut etanol 70 % (2250 ml) dan dibiarkan selama lima hari sambil sekali-kali dilakukan pengadukan, untuk mencegah terjadinya kejenuhan. Setelah lima hari disaring sehingga diperoleh ampas dan filtrat (ekstrak cair). Ampas ditambah cairan penyari secukupnya diaduk dan diserkai, sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Toples ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, diendapkan selama dua hari untuk menghindari kemungkinan masih adanya serbuk ikutan hasil penyarian, setelah diendapkan filtrat dipisahkan dari endapan ikutan. Selanjutnya dilakukan penguapan. Penguapan dilakukan dengan menggunakan evaporator. Penguapan berlangsung sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental inilah yang akan digunakan dalam uji diuretik.
5. Uji Diuretik: semua hewan uji yang akan digunakan sebanyak 25 ekor tikus diadaptasikan dalam laboratorium selama 7 hari dan dipuasakan selama 12-18 jam sebelum perlakuan, namun tetap diberi minum ad libitum. Hewan uji dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan secara acak. Adapun perlakuan untuk masing-masing kelompok hewan uji adalah sebagai berikut:
c. Kelompok III, diberi perlakuan ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,18 g/kg BB (2,5 ml/200 g BB), peroral;
d. Kelompok IV, diberi perlakuan ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,36 g/kg BB (2,5 ml/200 g BB), peroral;
e. Kelompok V, diberi perlakuan ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,72 g/kg BB (2,5 ml/200 g BB), peroral.
6. Cara Analisis Hasil: data volume urin hewan uji yang didapat setelah 1, 2, 3, 6, 9, 12 dan 24 jam dikumpulkan, berdasarkan hasil tersebut dilakukan uji statistik. Data yang diperoleh kemudian dicari dengan luas daerah di bawah kurva (AreaUnder the Curve). Kemudian data AUC diuji distribusi normalnya dengan uji Kolmogorov-Smirnov, sedang keseragaman variannya diuji dengan uji Levene menggunakan taraf kepercayaan 95%. Apabila data terdistribusi normal dan homogen, dilakukan ANAVA (analisis Varian) satu jalan dan jika berbeda bermakna, dilanjutkan dengan uji Least Significant Difference (LSD) dengan taraf kepercayaan 95%. Apabila data terdistribusi tidak normal, dilakukan uji Kruskal Wallis dan jika berbeda bermakna dilanjutkan dengan uji Mann Whitney dengan taraf kepercayaan 95%. Adanya efek diuretik secara keseluruhan dari bahan uji dapat diketahui dengan membandingkan AUC waktu pengamatan versus volume urin dari kelompok bahan uji dengan AUC kontrol negatif. Dilakukan uji yang sama terhadap data volume urin kumulatif jam ke-1 sampai jam ke-12, data volume urin jam ke-12 sampai jam ke-24 dan data volume jam ke-1 sampai jam ke-24.
1b, 2b, 3b, 4b, 12b, 13b, 14b, 17b, 18b, 19b, 20b, 21b, 22b, 23b, 24b, 25a………99………Euphorbiaceae. 1b, 36b, 39b, 40b, 42b, 54b, 61b, 63b, 66b, 67a,
68a………Justicia.
1……… Justicia gendarussa Burm. F.
Hasil Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Gandarusa
Serbuk daun gandarusa dengan bobot 300 gram disari dengan etanol 70% dan diperoleh ekstrak etanol daun gandarusa sebanyak 43,15 gram, berarti rendemennya adalah 14,38%.
Uji Diuretik
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek diuretik ekstrak etanol daun gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F) pada tikus putih jantan Wistar dengan menggunakan pembanding furosemid dosis 21,6 mg/kg BB sebagai kontrol positif dan suspensi PVP 5% sebagai kontol negatif. Untuk memperkecil variabilitas antar hewan uji, maka hewan yang digunakan harus mempunyai keseragaman, yaitu memiliki berat badan antara 130-200 gram, umur 2-3 bulan, diberi makanan dan minuman yang sama dan dalam kondisi sehat. Pengelompokan hewan uji dilakukan secara random (acak), masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor.
Pada penelitian menggunakan hewan uji tikus karena tikus merupakan hewan dengan model yang sesuai untuk evaluasi obat-obat yang mempengaruhi ginjal (Kusumawati, 2004).
Hewan uji yang digunakan tikus jantan karena kondisi biologisnya lebih stabil bila dibandingkan dengan tikus betina. Pada hewan betina, secara berkala dalam tubuhnya mengalami perubahan kondisi biologis yaitu pada masa-masa
terlebih dahulu selama 12-18 jam dengan hanya diberi minum ad libitum. Tujuannya agar kondisi hewan uji sama dan mengurangi pengaruh makanan yang dikonsumsi terhadap absorpsi sampel yang diberikan.
Apabila tahap persiapan telah selesai, kemudian dilakukan uji dengan pemberian ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,18 g/kg BB, 0,36 g/kg BB dan 0,72 g/kg BB. Sebagai pembanding digunakan furosemid yang merupakan diuretik kuat sebagai kontrol positif dan suspensi PVP 5% sebagai kontrol negatif.
Volume air minum yang dikonsumsi oleh hewan uji dari jam ke-1 sampai 12 tidak dilakukan uji ANAVA satu jalan karena air minum diberikan secara per oral dengan volume pemberian 2,5/ 200 g ml tiap 3 jam. Begitu juga volume air minum yang dikonsumsi dari jam ke-12 sampai 24 diberikan secara peroral sebanyak 5 ml/ 200 g. Hal ini dilakukan untuk menyeragamkan kondisi dari hewan uji, karena dikhawatirkan dengan masuknya air minum yang tidak seragam kemungkinan berpengaruh pada efek diuretik yang dihasilkan baik pada kontrol positif maupun perlakuan tiap dosis ekstrak etanol daun gandarusa.
Data volume urin diukur pada jam ke- 1, 2, 3, 6, 9, 12 dan 24. Data yang terkumpul merupakan data volume urin tiap waktu (ml). Dari data volume urin tiap waktu dapat dihitung volume urin kumulatif.
Data volume urin kumulatif menggambarkan kenaikan volume urin secara keseluruhan selama waktu pengamatan. Data volume urin kumulatif jam ke 1-12, urin kumulatif jam ke 12-24 dan urin kumulatif jam ke 1-24 tiap waktu pengamatan (mean+SD) tersaji Tabel 1.
0 2 4 6 8 10 12 0 5 10 15 20 25
Waktu pengamatan (jam ke-)
V o lu m e u r in k u m u la ti f (m l)
kontrol positif (furosemid 21,6 mg/kg BB) kontrol negatif (suspensi PVP 5% 2,5 ml/200 g BB) ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,18 g/kg BB ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,36 g/kg BB ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,72 g/kg BB 1 Kontrol Positif 21,6mg/ kg BB 8,90+0,70 2,85+0,93 11,75+1,24 2 Kontrol Negatif 2,5 ml/ 200g BB 4,79+0,35 1,95+0,48 6,74±0,70
3 Ekstrak etanol daun
gandarusa dosis 0,18g/ kg BB
6,26+1,55 3,15+1,21 9,41+2,02
4 Ekstrak etanol daun
gandarasa dosis 0,36g/ kg BB
4,45+0,77 1,90+0,69 6,36+1,41
5 Ekstrak etanol daun
gandarasa dosis 0,72,g/ kg BB
5,69+0,91 2,64+0,73 8,33+1,49
Urin kum = urin kumulatif
. Urin kumulatif 1-12 menggambarkan kenaikan volume urin pada jam ke 1-12. Hasil ANAVA satu jalan menunjukan perbedaan yang bermakna (p=0,000). Hasil uji LSD, kontrol negatif berbeda bermakna dengan kontrol positif dan
Gambar 1. Kurva Hubungan Waktu Pengamatan (Jam) Terhadap Volume Urin Kumulatif (ml) setelah Perlakuan pada Tikus Putih Jantan Wistar.
Urin kumulatif 12-24 menggambarkan kenaikan volume urin pada jam ke 12-24. Hasil ANAVA satu jalan menunjukan tidak ada perbedaan yang bermakna dengan kontrol positif (p=0,113). Hal ini berarti pada jam 12-24 sudah tidak ada kenaikan volume urin lagi (kemungkinan karena pada jam ke 12-24 furosemid maupun ekstrak etanol daun gandarusa sudah terekskresi).
Urin kumulatif 1-24 menggambarkan kenaikan volume urin secara keseluruhan yaitu pada jam ke 1-24. Hasil uji statistik data terdistribusi normal, sedangkan homogenitas varian tidak sama. Kemudian data ditransform ke dalam bentuk Lag (penurunan) sehingga dihasilkan data yang homogenitasnya sama. Dari hasil ANAVA satu jalan menunjukan perbedaan yang bermakna (p=0,000). Hasil uji LSD, kontrol negatif berbeda bermakna dengan kontrol positif. Hal ini berarti furosemid mempunyai efek diuretik pada jam ke 1-24 karena mampu meningkatkan volume urin. Sedangkan ekstrak etanol daun gandarusa tidak memiliki efek diuretik secara keseluruhan karena tidak ada perbedaan yang bermakna dengan kontrol negatif, sehingga tidak mampu menaikkan volume urin.
Adanya khasiat sebagai diuretik dari ekstrak etanol daun gandarusa diketahui dengan membandingkan AUC (Area Under the Curve) volume urin tiap waktu pengamatan dari tiap kelompok perlakuan ekstrak etanol daun gandarusa dengan AUC kontrol negatif. Semakin besar AUCnya berarti semakin besar volume urin yang dihasilkan. Dari hasil ini dapat diketahui apakah ekstrak etanol daun gandarusa mempunyai kemampuan menaikkan volume urin atau tidak. Data AUC1-12, AUC12-24 dan AUC1-24 urin tiap waktu pengamatan dari masing-masing perlakuan (mean+SD) dapat dilihat pada Tabel 2.
21,6 mg/kg BB
2 Kontrol Negatif
2,5 ml/ 200g BB
9,82+0,81 19,76+4,90 29,78+5,17 -
3 Ekstrak etanol daun
gandarusa dosis 0,18 g/kg BB
13,79+3,09 30,28+8,14 44,08+8,78 47,98+29,4
4 Ekstrak Etanol daun
gandarusa dosis 0,36 g/kg BB
12,45+2,00 25,99+2,52 38,45+3,35 29,06+11,2
5 Ekstrak Etanol daun
gandarusa dosis 0,72 g/kg BB
14,65+2,81 28,68+2,04 43,33+4,15 45,44+13,9
Tabel 3. Data Nilai Signifikan AUC1-12, AUC12-24, dan AUC1-24 antar Kelompok Perlakuan dari Uji LSD
Nilai Signifikansi AUC Kelompok I II III IV V I 0,000* 0,049* 0,006* 0,151 II 0,011 0,077 0,003* III 0,355 0,554 IV 0,137 1-12 V I 0,069 0,256 0,928 0,494 II 0,006* 0,083 0,017 III 0,222 0,642 IV 0,440 12-24 V I 0,001* 0,988 0,158 0,856 II 0,001* 0,034* 0,002* III 0,154 0,845 IV 0,214 1-24 V * = berbeda signifikan p < 0,05
Kelompok I = kontrol positif (furosemid 21,6 mg/kg BB) II = kontrol negatif (suspensi PVP 2,5 ml/200g BB) III = ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,18 g/kg BB
sudah menunjukkan adanya pengaruh terhadap kenaikan volume urin pada hewan uji. Hasil uji LSD yang diperoleh menunjukkan bahwa kontrol negatif berbeda bermakna dengan kontrol positif, ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,18 g/kg BB dan dosis 0,72 g/kg BB. Hal ini berarti, pada kontrol positif dan kedua dosis ekstrak etanol tersebut mempunyai efek sebagai diuretik secara bermakna pada jam ke 1-12. Sedangkan ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,36 g/kg BB tidak menunjukan perbedaan yang bermakna dengan kontrol negatif (tidak menunjukkan efek diuretik pada jam 1-12).
AUC12-24 dapat digunakan untuk melihat efek diuretik pada jam ke 12-24. hasil ANAVA satu jalan diperoleh data berbeda tidak bermakna (p = 0,056). Hal ini berarti, pemberian ekstrak etanol daun gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F ) pada jam ke 12-24 tidak berpengaruh terhadap kenaikan volume urin pada hewan uji. Hasil uji LSD yang diperoleh menunjukkan bahwa kontrol negatif berbeda bermakna dengan ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,18 g/kg BB dan dosis 0,72 g/Kg BB yang berarti pada dosis tersebut mempunyai efek diuretik secara bermakna pada jam ke 12-24 dan tidak ada perbedaan yang bermakna dengan kontrol positif, ekstrak etanol daun gandarusa dosis 0,36 g/kg BB. Hal ini mungkin dikarenakan pada jam ke 12-24 furosemid dan ekstrak etanol pada dosis tersebut sudah terekskresi (tidak menghasilkan efek diuretik lagi). Dengan
kata lain, ekskresi urin pada jam 12-24 sudah normal kembali.
Efek diuretik ekstrak etanol daun gandarusa pada jam ke 1-24 dapat dilihat dengan membandingkan AUC kelompok perlakuan ekstrak etanol daun gandarusa dengan AUC kontrol negatif pada jam ke 1-24. Hasil ANAVA terhadap AUC1-24
menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna (p = 0,005). Hasil uji LSD menunjukkan bahwa kelompok yang berbeda bermakna dengan kontrol negatif adalah kelompok perlakuan dengan pemberian furosemid (kontrol positif) dan
Dari data AUC1-24 yang diperoleh, dapat dilakukan perhitungan persen daya diuretik purata AUC1-24 tiap kelompok perlakuan terhadap kontrol negatif yang terdapat pada Tabel 2. Dari tabel tersebut, dapat dilihat persen daya diuretik yang dihasilkan oleh ekstrak etanol daun gandarusa.
Untuk melihat pengaruh dosis terhadap efek diuretik yang dihasilkan dengan membandingkan nilai AUC antar dosis. Pada AUC1-12 perbandingan antar dosis ada perbedaan yang bermakna pada dosis 0,18 g/ kg BB dengan dosis 0,72 g/ kg BB (p=0,001). Hal ini menunjukkan bahwa efek diuretik yang dihasilkan pada jam ke 1-12 dipengaruhi oleh kenaikan dosis. Pada AUC12-24 perbandingan antar dosis tidak berbeda bermakna pada dosis 0,18 g/ kg BB dengan dosis 0,36 g/ kg BB dan dosis 0,72 g/ kg BB (p=0,056). Hal ini menunjukkan bahwa efek diuretik yang dihasilkan pada jam ke 12-24 tidak dipengaruhi oleh kenaikan dosis. Pada AUC1-24 ada perbedaan yang bermakna pada dosis 018, g/ kg BB dengan dosis 0,36 g/ kg BB dan dosis 0,72 g/ kg BB (p=0,005). Hal ini berarti efek diuretik yang dihasilkan pada jam ke 1-24 dipengaruhi oleh kenaikan dosis.
Dari penelitian sebelumnya (Sari, 2006), telah dilakukan uji efek diuretik infusa pada daun gandarusa dengan dosis 1,25 g/ kg BB mampu memberikan efek diuretik pada tikus putih jantan galur wistar sebesar (73,53 + 10,45) %. Sedangkan dari hasil yang diperoleh dalam penelitian ini, diketahui bahwa ekstrak etanol daun gandarusa dengan dosis 0,18 g/ kg BB, dosis 0,36 g/ kg BB dan dosis 0,72 g/ kg BB mampu memberikan efek diuretik pada tikus putih jantan galur Wistar, dengan daya diuretik sebesar (47,98 ± 29,49), (29,06 ± 11,24), (45,44 ± 13,93) %. Hal ini berarti efek diuretik yang dihasilkan pada infusa lebih besar dibanding ekstrak etanol daun gandarusa. Efek diuretik infusa lebih besar mungkin disebabkan senyawa yang berkhasiat sebagai diuretik sangat mudah larut dalam pelarut yang kepolarannya tinggi. Dalam hal ini, air adalah pelarut yang sangat polar dan hanya senyawa-senyawa yang polar saja yang dapat larut
volume urin menjadi berkurang.
KESIMPULAN DAN SARAN