Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan Kelautan Institut Pertanian Bogor mulai bulan Juni-Desember 2012.
Bahan
Untuk mengisolasi bakteri digunakan bahan-bahan antara lain: alkohol analis 50%, media TSA, TSB, larutan fisiologis, antibiotik polimiksin B dan streptomisin. Untuk menganalisa kemampuan bakteri dalam proses nitrifikasi dan denitrifikasi digunakan dengan bahan-bahan sebagai berikut:
1. Media basal heterotrof untuk nitrifikasi terdiri dari: K2HPO4.3H2O; KH2PO4; MgCl2.6H2O; NaHCO3; Fe Cl3.6H2O; CaCl2.2H2O; NH4
2. Media basal untuk denitrifikasi terdiri dari: Na asetat, KNO
Cl; EDTA; Glukosa; Aquades (Widiyanto 2005).
3, (NH4)2SO4, K2HPO4.3H2O MgSO4.7H2O, KH2PO4, CaCl2.2H2
3. Synthetic pond water terdiri dari: KNO
O dan ekstrak ragi (Widiyanto 2005)
3; NaNO2; (NH4) 2SO4; H3PO4 Sedangkan bahan untuk analisa amonia, nitrit, nitrat adalah MnSO
; ekstrak ragi; glukosa (Lalloo et al. 2007)
4, clorox, sulfanilamide, brucine dan H2SO4 pekat. Untuk uji coba in vivo digunakan ikan lele dan mas berukuran 4-5 cm dan air bekas pemeliharaan ikan lele dengan kadar total amonia nitrogen 6,12 mg/l TAN.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: mikroskop, spektrofotometer, sentrifuse, oven, inkubator, vortex, shaker, mikropipet, cawan petri, botol kaca ukuran 1,5 liter, akuarium dan aerator.
Prosedur Analisa data
Pengambilan Sampel Air, Akar Tanaman Air dan Sedimen
Sampel air, tanaman air dan sedimen diambil dari kolam pembesaran ikan lele dengan luas 100 m2, kedalaman air 1 m, padat penebaran 150 ekor/m2, umur ikan 45 hari, sistem budidaya intensif dan tidak ada pergantian air. Sampel diambil dengan menggunakan botol steril bervolume 300 ml. Air diambil dari permukaan sampai kolom air di bagian yang sama dengan pengambilan sampel sedimen. Akar tanaman air diperoleh dari akar eceng gondok yang tumbuh di atas permukaan kolam. Sedimen diambil dari bagian permukaan dasar kolam sampai kedalaman 15 cm dengan menggunakan pipa paralon 2 inci dan dimasukkan ke dalam botol plastik bervolume 300 ml. Semua sampel tersebut dimasukkan ke dalam styrofoam yang telah diberi es batu.
Isolasi dan Seleksi Bakteri Bacillus sp.
Isolasi dan seleksi bakteri dari genus Bacillus dilakukan berdasarkan penelitian oleh Lalloo et al. (2007). Setiap sampel sebanyak 1 g disuspensikan ke dalam 3 ml larutan NaCl (0,9%), kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media TSB sebanyak 9 ml dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 300C, diikuti dengan inkubasi pada 450C selama 10 menit dalam oven untuk mengaktifkan proses sporulasi. Etanol (50%) ditambahkan sebanyak 20 ml pada setiap sampel,diinkubasi pada suhu 200C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 10.000 rpm, supernatan dituang dan pelet yang dihasilkan diinkubasi pada suhu 1050C dalam oven selama 5 menit. Pelet kering dilarutkan dalam 20 ml larutan garam fisiologis steril dan diencerkan secara serial sampai 10-4 dengan kenaikan secara bertahap 10-1. Sebanyak 0,1 ml dari setiap seri pengenceran disebar dalam cawan petri yang berisi TSA yang diberi polimiksin B (5 mg/l). Biakan tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 300C. Koloni tunggal yang terisolasi dari cawan dimurnikan dan dilakukan pewarnaan Gram
dan spora untuk selanjutnya dilakukan seleksi bakteri dalam media basal heterotrof untuk nitrifikasi dan media basal denitrifikasi.
Seleksi Bakteri dalam Media Basal Heterotof untuk Nitrifikasi dan Media Basal untuk Denitrifikasi
Untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam proses nitrifikasi maka dilakukan pengujian isolat dalam media basal heterotrof (glukosa sebagai sumber karbon) dengan amonia sebagai satu-satunya sumber nitrogen (Lampiran 1). Isolat-isolat bakteri yang diperoleh ditumbuhkan dalam 20 ml media pada erlenmeyer bervolume 100 ml, kemudian diinkubasi selama 3 hari di dalam shaker pada suhu 280C dengan kecepatan 130 rpm sebagai inokulan isolat uji. Masing-masing inokulan isolat uji diambil sebanyak 2 ml dan diinokulasikan ke dalam 50 ml media basal heterotrof untuk nitrifikasi pada erlenmeyer volume 250 ml dengan konsentrasi amonia nitrogen sekitar 130 mg/l. Inkubasi dilakukan selama 7 hari pada suhu 280
Untuk menyeleksi kemampuan bakteri dalam proses denitrifikasi, maka dilakukan pengujian isolat dalam media basal untuk denitifikasi dengan kalium nitrat sebagai sumber nitrogen (Lampiran 1). Isolat bakteri yang diperoleh ditumbuhkan pada 20 ml media dalam erlenmeyer bervolume 100 ml, kemudian diinkubasikan selama 5 hari di dalam shaker pada suhu 28
C di atas shaker dengan kecepatan 130 rpm. Pengukuran konsentrasi total amonia nitrogen (TAN), nitrit dan nitrat dan populasi bakteri dilakukan setiap 2 hari yaitu pada hari ke 0, 2, 4 dan 6. Sebagai kontrol digunakan media yang tidak dinokulasi isolat bakteri.
0C dengan kecepatan 130 rpm sebagai inokulan isolat uji. Masing-masing inokulan isolat uji diambil sebanyak 2 ml dan diinokulasikan dalam 50 ml media pada erlenmeyer bervolume 100 ml dengan konsentrasi nitrat sekitar 530 mg/l. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 16 hari. Pengukuran konsentrasi (TAN), nitrit, nitrat dan populasi bakteri dilakukan setiap 8 hari, yaitu hari ke 0, 8 dan 16. Sebagai kontrol digunakan media yang tidak dinokulasi isolat bakteri. Isolat bakteri yang menunjukkan penurunan konsentrasi TAN dan nitrat tertinggi akan digunakan untuk uji selanjutnya.
Uji Aktivitas Nitrifikasi dan Denitrifikasi Isolat Terpilih secara in Vitro pada Synthetic Pond Water
Isolat bakteri terpilih dengan kemampuan nitrifikasi dan denitrifikasi tertinggi selanjutnya diuji pada synthetic pond water (Lalloo et al. 2007). Komposisi synthetic pond water dapat dilihat pada Lampiran 2. Air yang digunakan adalah akuades yang telah disterilkan dan pH dipertahankan pada kisaran 7. Isolat-isolat bakteri terpilih pada tahap sebelumnya, ditumbuhkan dalam 20 ml synthetic pond water pada erlenmeyer bervolume 100 ml, kemudian diinkubasi selama 3 hari di dalam shaker pada suhu 280C dengan kecepatan 130 rpm sebagai inokulan isolat uji. Masing-masing inokulan isolat uji diambil sebanyak 2 ml dan diinokulasikan ke dalam 50 ml synthetic pond water pada erlenmeyer volume 250 ml kemudian diinkubasi suhu pada 300
Setelah itu setiap erlenmeyer yang berisi isolat bakteri diambil secara aseptik untuk dilakukan pengukuran pertumbuhan bakteri, konsentrasi TAN, nitrit dan nitrat. Pengukuran dilakukan sebelum inokulasi dan setelah inokulasi setiap hari sampai fase pertumbuhan stasioner tercapai. Laju pertumbuhan bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan. Media yang digunakan untuk hitungan cawan adalah media TSA yang telah diberi polimiksin B (5 mg/l TSA). Tingkat penurunan konsentrasi amonia, nitrat dan nitrit oleh masing-masing isolat dalam synthetic pond water ditentukan dari plot konsentrasi senyawa-senyawa tersebut terhadap waktu. Isolat yang menunjukkan penurunan konsentrasi TAN, nitrit dan nitrat tertinggi akan digunakan selanjutnya dalam uji in vivo. Isolat bakteri terpilih selanjutnya diidentifikasi dengan KIT API 20E dan API 50CHB untuk penentuan spesiesnya.
C pada shaker dengan kecepatan 130 rpm.
Uji Kemampuan Isolat Terpilih secara In Vivo
Isolat terpilih pada uji vitro diuji secara in vivo untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menurunkan konsentrasi total amonia nitrogen (TAN), nitrat dan nitrit pada media pemeliharaan ikan. Percobaan dilakukan di akuarium kaca berukuran 60 x 30 x 30 cm yang berisi 30 liter air dengan ketinggian air 20 cm. Ikan yang digunakan adalah benih ikan lele dan mas berukuran 4-5 cm. Air yang digunakan adalah air kolam bekas pemeliharaan lele yang diberi pelet sampai kadar TAN melebihi ambang batas toleransi ikan (6,12 mg/l TAN). Percobaan ini terdiri dari dua perlakuan dan dua kontrol. Kontrol masing- masing berisi 30 ekor ikan mas dan 30 ekor ikan lele sebanyak 3 ulangan tanpa penambahan bakteri probiotik. Sedangkan perlakuan masing-masing berisi 30 ekor ikan mas dan 30 ekor ikan lele sebanyak 3 ulangan dengan penambahan bakteri probiotik (109 cfu/ml) sebanyak 3 ml per akuarium. Pemberian pakan dilakukan 2 kali sehari (secara ad satiation). Ikan dipelihara dengan sistem tidak ganti air (zero water exchange). Sampel air diambil setiap hari sekali untuk mengukur oksigen, suhu, kesadahan, pH, total populasi bakteri probiotik, konsentrasi TAN, nitrit dan nitrat. Populasi bakteri dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni yang tumbuh pada media TSA yang diberi polymixin B dan streptomisin (5 mg/l TSA) dikalikan faktor pengenceran.
Parameter yang Diamati
Kemampuan Isolat Bakteri dalam Proses Nitrifikasi
Parameter yang diukur adalah parameter kualitas air meliputi konsentrasi senyawa TAN, nitrit dan nitrat. Persentase konsentrasi TAN yang teroksidasi dan senyawa nitrit dan nitrat yang terbentuk dapat dihitung dengan rumus di bawah ini (Widiyanto 2005) :
Keterangan:
AO : Persentase konsentrasi TAN yang teroksidasi AK : Konsentrasi TAN pada media kontrol
AP : Konsentrasi TAN pada media yang diinokulasi bakteri
Konsentrasi nitrat atau nitrit yang terbentuk adalah konsentrasi nitrat atau nitrit pada suspensi perlakuan dikurangi konsentrasi nitrit atau nitrat yang yang terdapat pada suspensi kontrol. Persentase konsentrasi nitrat yang terbentuk (PNT) atau persentase nitrit yang terbentuk (PNI) dihitung dengan rumus berikut :
Keterangan :
PNT : Persentase konsentrasi nitrat yang terbentuk
NTP : Konsentrasi nitrat pada suspensi perlakuan (diinokulasi bakteri) NTK :Konsentrasi nitrat pada kontrol
AK : Konsentrasi TAN pada media kontrol
AP : Konsentrasi TAN pada media yang diinokulasi bakteri
Sedangkan konsentrasi nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus :
Keterangan :
PNI : Persentase konsentrasi nitrit yang terbentuk
NIP : Konsentrasi nitrit pada suspense perlakuan (diinokulasi bakteri) NIK : Konsentrasi nitrit pada kontrol
AK : Konsentrasi TAN pada media kontrol
AP : Konsentrasi TAN pada media yang diinokulasi bakteri Kemampuan Isolat Bakteri dalam Proses Denitrifikasi
Parameter yang diukur adalah konsentrasi nitrat yang tereduksi dengan rumus sebagai berikut (Widiyanto 2005) :
Persentase konsentrasi nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Persentase konsentrasi gas nitrogen yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Kualitas Air
Parameter kualitas air yang termasuk parameter fisika dan kimia yaitu suhu (thermometer), TAN (metode phenate), nitrit (metode sulfanilamide) dan nitrat (metode brusin), pH (pH meter), oksigen terlarut (DO meter) dan kesadahan diukur setiap hari. Prosedur kerja pengukuran parameter disajikan pada Lampiran 2.
Uji Statistik
Uji statistik dilakukan pada percobaan in vivo. Untuk desain percobaan ini merupakan model eksperimen laboratorium dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua perlakuan, dua kontrol dan tiga ulangan untuk setiap kontrol dan perlakuan. Nilai parameter TAN, nitrit dan nitrat pada kontrol dan perlakuan diuji menggunakan One Way ANOVA.