Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Januari sampai Juni 2012. Pembuatan ekstrak parengpeng dan beberapa analisis seperti analisis total asam, total gula, uji mikrobiologi dan pengukuran pH dilakukan di Laboratorium Kimia PAU (Pusat Antar Universitas) IPB Bogor. Uji fitokimia parengpeng dilakukan di laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB Baranangsiang, Bogor. Identifikasi tanaman parempeng dilakukan di Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong. Pembuatan gula semut dilakukan langsung di Desa Pegradin, Kecamatan Jasinga, Kabupaten Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan berupa : daun tanaman parempeng, nira aren segar, alkohol 70%, akuades, medium nutrient agar (NA), medium nutrient browth (NB), medium deMan’s Rogosa Sharpe Agar (MRSA), medium deMan’s
Rogosa Sharpe Broth (MRSB), medium potato dextrose agar (PDA), medium
Plate Count Agar (PCA), asam tartarat, kultur murni berupa Lactobacillus delbrueckii, Leuconostoc mesenteroides,dan Saccharomyces cerevisiae.
Alat
Alat yang digunakan berupa blender, labu erlemeyer, shaker, kertas Bolmant, corong, pipet ukur, destilator, oven, dan spektrofotometer untuk analisis kimia, autoclave, inkubator, cawan petri, tabung reaksi, pipet mikro, pembakar Bunsen dan jarum Ose.
Tahap Penelitian
Tahapan penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada diagram alur penelitian pada Gambar 6.
Gambar 6 Skema Alur Penelitian Kajian Pengawetan Nira Aren Menggunakan Ekstrak Parengpeng
Identifikasi tanaman parengpeng
Ekstraksi dengan 3 jenis pelarut : Etanol ( polar),
Heksana (non polar), Etil asetat (semi polar)
Uji aktifitas antimikroba (penentuan MIC) :
Lactobacillus delbrueckii, Leuconostoc mesenteroides Saccharomyces cerevisiae Ekstrak dengan pelarut terpilih (rendemen terbesar)
Pemilihan jenis pelarut
Uji Fitokimia Flavonoid Alkaloid Tannin Saponin Steroid Triterpenoid MIC terpilih ( 6%)
Pembuatan gula semut berdasarkan MIC terpilih
Penentuan mutu gula semut dan Uji organoleptik
Aplikasi ekstrak daun parengpeng terhadap nira aren selama 13 jam terhadap : total mikroba, jumlah BAL, jumlah khamir,
Total gula, Total asam dan pH T A H A P I T A H A P II T A H A P III T A H A P IV
Penelitian ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu :
Tahap I
Determinasi Daun Parengpeng
Daun parempeng diambil dari Desa Pegradin, Kecamatan Jasinga, Kabupaten Bogor. Determinasi tanaman dilakukan di Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong.
Sebelum diekstrak, daun terlebih dahulu disortir untuk mendapatkan kualitas daun yang baik. Pemilihan daun didasarkan keseragaman ukuran, umur, warna dan bentuk daun. Selanjutnya daun dipisahkan dari tangkai dan kemudian daun dikeringkan menggunakan oven pada suhu 50 °C selama 24 jam. Daun yang sudah kering selanjutnya dihancurkan dengan menggunakan hammer mill. Proses ekstraksi daun parempeng dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut yang memiliki polaritas berbeda, yaitu pelarut heksana (nonpolar), etil asetat (semipolar) dan etanol (polar). Ekstraksi dilakukan pada suhu ruang selama 24 jam.
Proses ekstraksi diawali dengan perendaman serbuk daun parengpeng sebanyak 25 g direndam dalam pelarut heksana, etil asetat dan etanol dengan perbandingan 1:10 (b/v) sambil di kocok dalam shaker. Campuran tersebut kemudian disaring dengan kertas Bolmant dan selanjutnya ampas serbuk daun parengpeng tersebut dimaserasi kembali dengan perlakuan sama seperti di atas. Filtrat yang diperoleh selanjutnya dipekatkan dengan menggunakan vakum evaporator. Filtrat tersebut diambil sebagai ekstrak heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol. Ekstrak yang diperoleh digunakan sebagai sampel untuk analisis fitokimia dan pengujian aktivitas lainnya. Harborne (1996) menyatakan rendemen ekstrak dalam persen ekstrak kering (tanpa pelarut) dapat dihitung dengan persamaan :
x 100% = Rendemen ekstrak
Tahap II
Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Fitokimia Ekstrak Daun Parengpeng
Penentuan kandungan fitokimia secara kualitatif dengan metode Harborne, 1996 dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya golongan senyawa aktif yang terdapat pada daun parempeng meliputi alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, steroid dan triterpenoid. Prosedur analisis dapat dilihat pada Lampiran 1.
Tahap III
Penentuan Minimum Inhibitory Concentrate (MIC) Terhadap Bakteri Uji dengan Metode Kontak (Vigil et al. 2005) dan Kajian Pengaruh Penambahan
Ekstrak Sebagai Pengawet Nira Aren Selama 13 Jam
Persiapan kultur mikroba
Penyegaran kultur mikroba dilakukan dengan menginokulasi mikroba sebanyak 0,1 ml dalam 10 ml nutrient broth (NB), kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah inkubasi selama 24 jam, mikroba siap untuk digunakan pada uji MIC selanjutnya.
Penentuan MIC (Minimum Inhibitory Concentration)
Uji aktivitas mikroba dilakukan dengan menentukan nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ekstrak parengpeng terhadap bakteri yang uji. Kultur murni yang digunakan adalah Lactobacillus delbrueckii, Leuconostoc mesenteroides, Saccharomyces cerevisiae. Uji MIC dilakukan untuk mengetahui dosis minimum ekstrak daun parengpeng yang dapat digunakan untuk mengetahui penghambatan pertumbuhan mikroba yang diperoleh dengan menentukan konsentrasi yang menunjukkan penurunan jumlah mikroba uji sebanyak 90-92% (Cosentino et al. 1999). Prosedur penentuan MIC diawali dengan pengambilan inokulum yang telah disegarkan dan dimasukkan ke dalam masing-masing tabung yang telah berisi media dan ekstrak daun parengpeng dengan konsentrasi yang berbeda-beda dan diinkubasikan pada suhu ruang dengan menggunakan shaker
kecepatan 150 rpm selama 24 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung. Penghitungan jumlah total koloni mikroba yang tumbuh dilakukan dengan metode
Bacteriological Analytical Manual (BAM) tahun 2001 (Lampiran 2).
Penghitungan penghambatan pertumbuhan mikroba (MIC) menggunakan persamaan berikut :
x 100% (Zuraida 2008)
keterangan:
Nt = Jumlah koloni mikroba (Cfu/ml) inkubasi selama 24
No = Jumlah koloni mikroba awal (Cfu/ml)
Berdasarkan hasil perhitungan nilai MIC terpilih konsentrasi 6% karena pada konsentrasi tersebut pertumbuhan mikroba pada nira aren sudah terhambat.
Penelitian selanjutnya adalah mengkaji pengaruh penambahan konsentrasi ekstrak daun parengpeng senyawa antimikroba untuk mengawetkan nira aren terhadap konsentrasi ekstrak daun parengpeng 0% dan 6% terhadap total mikroba, jumlah bakteri asam laktat dan jumlah khamir pada nira aren tiap 1 jam selama inkubasi 13jam dan konsentrasi ekstrak daun parengpeng 0%, 6%, 9%, 12% terhadap perubahan total gula, total asam dan pH (Lampiran 3).
Tahap VI:
Pembuatan Gula Dan Analisis Kualitas Gula
Uji Organoleptik Mutu Hedonik, Analisis Kandungan Kimia dan uji Kuantitatif Fitokimia Gula Semut Ekstrak Parengpeng
Konsentrasi ekstrak parengpeng terpilih yang ditambahkan pada pembuatan gula semut adalah 6 %. Nilai ini diperoleh dari hasil perhitungan nilai MIC dan pertimbangan agar cita rasa gula semut dapat diterima oleh konsumen. Penambahan ekstrak parengpeng sebanyak 6 % berdasarkan uji MIC sudah dapat dikatakan sebagai penghambat pertumbuhan bakteri. Penambahan ekstrak parengpeng dengan konsentrasi lebih tinggi dikhawatirkan dapat menurunkan penerimaan masyarakat terhadap gula semut karena rasanya pahit.
Ekstrak daun parempeng yang ditambahkan secara langsung dalam proses penyadapan nira dengan konsentrasi terpilih selanjutnya diolah menjadi gula aren. Gula aren atau gula semut yang dihasilkan kemudian diuji organoleptik. Uji organoleptik yang dilakukan meliputi uji hedonik dan uji mutu hedonik (Rahayu 2001). Uji hedonik adalah uji untuk menilai tingkat kesukaan konsumen terhadap gula semut, meliputi warna, rasa, aroma, dan tekstur. Kedua uji ini dilakukan dengan menggunakan skala 1 sampai 9. Formulir uji organoleptik yang digunakan berupa kuisioner penilaian produk. Hasil uji hedonik digunakan untuk menentukan formula atau produk terpilih berdasarkan nilai rata-rata dan persentase dari masing-masing komponen rasa, warna, aroma dan tekstur. Sedangkan uji mutu hedonik adalah uji untuk mengidentifikasi karakteristik gula semut, meliputi warna, tekstur, rasa, aroma asap, aroma, dan aftertaste. Skala penilaian yang digunakan sama dengan uji hedonik yaitu 1 sampai dengan 9 (Lampiran 4). Panelis yang digunakan terdiri dari 30 panelis semi terlatih.
Analisis kandungan kimia gula dilakukan dengan metode Harborne (1996) untuk mengetahui : kadar air, kadar abu, kadar protein dan kadar lemak pada gula semut (Lampiran 5).
Analisis Kuantitatif Fitokimia Gula Semut Ekstrak Parengpeng Sebagai Gula Fungsional dilakukan untuk mengetahui kadar saponin, tannin dan flavonoid pada gula semut. Kadar saponn diuji dengan metode TLC scanner, tannin dan flavonoid diuji dengan metode Spektrofotometri.
Analisis Warna Gula Semut
Analisis warna secara kualitatif pada gula semut ekstrak parengpeng dilakukan untuk melihat pengaruh pengawet ekstrak terhadap warna gula semut. Alat analisis yang digunakan adalah chromameter tipe CR300. Angka hasil pemotretan chromameter CR300 adalah nilai tristimus untuk mengukur warna yang dipantulkan suatu permukaan. Angka yang terukur berupa nilai absolut maupun nilai selisih dengan warna standar. Nilai yang digunakan dalam penelitian ini berupa L, a*, dan b*. Nilai L menginterpretasikan kecerahan, nilai a(+) menginterpretasikan produk memiliki kecenderungan berwarna kemerahan, sedangkan nilai a(-) menandakan produk memiliki kecenderungan berwarna kehijauan. Nilai b(+) menginterpretasikan produk berwarna kekuningan
sedangkan nilai b(-) menandakan produk berwarna mengarah pada kebiruan (Yoshimura et al. 2001).
Deskripsi Gambar pembacaan nilai L, a*, dan b* dapat dilihat pada Gambar 7 dibawar ini.
Gambar 7 deskripsi Nilai L, a, b pada pembacaan chromamater Keterangan : MU : Merah keunguan M : Merah KM : Kuning kemerahan KH : Kuning Kehijauan H : Hijau BH : Biru Kehijauan B : Biru BU : Biru Keunguan
Prosedur Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini digunakan untuk melihat pengaruh ekstrak parengpeng terhadap perubahan inkubasi nira aren (tahap III) adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial 2 faktor. Faktor pertama adalah faktor A yaitu kosentrasi (%) ekstrak Parengpeng dengan 4 taraf, yaitu konsentrasi 0% (A1), konsentrasi 6% (A2), konsentrasi 9 % (A3) dan konsentrasi 12% (A4). Faktor kedua adalah lamanya inkubasi nira (jam) dengan 13 taraf, yaitu jam ke-0 (B1), jam ke-1 (B2), jam ke-2 (B3), jam ke-3 (B4), jam ke-4 (B5), jam ke-5 (B6), jam ke-6 (B7), jam ke-7 (B8), jam ke-8 (B9), jam ke-9 (B10), jam ke-10 (B11), jam ke-11 (B12), jam ke-12 (B13). Setiap kombinasi faktor perlakuan diulang dua kali. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (analysis of variance) dengan uji lanjut Duncan. Model rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut (Gomez dan Gomez 1995):
Yijk = μ + Ai + Bj + (AB)ij + εijk
Keterangan :
Yijk = Hasil pengamatan pada perubahan nira aren (A) taraf ke-i, waktu/jam faktor (B) taraf ke-j
= Rata – rata yang sebenarnya
Ai = Pengaruh faktor konsentrasi ekstrak parengpeng taraf ke-i (i = 1, 2,3,4)
Bj = Pengaruh faktor waktu/jam taraf ke-j (j = 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13)
(AB)ijk = Pengaruh interaksi faktor A taraf ke-i dan faktor B taraf ke-j
εijk = Galat satuan percobaan taraf ke-i faktor A dan taraf ke-j faktor B. Rancangan berikutnya yang digunakan untuk mengevaluasi aplikasi MIC yang didapat dari percobaan pertama dalam produksi gula semut adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan 2 perlakuan dan 2 kali ulangan.
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan Sidik Ragam pada tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan. Analisis data menggunakan software SAS 9.1 dan software SPSS16 untuk melihat hubungan perbedaan mutu hedonik dan hedonik.