SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2007
SITI MUTTI SAWITRI. Ekspresi Gen Gα dan GST Pada Kedelai Kultivar Lumut Yang Mendapat Cekaman Aluminium. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Protein G subunit α berinteraksi dengan molekul reseptor yang berlokasi di membran plasma dan terlibat di dalam banyak regulasi sinyal transduksi. Ekspresi gen GST diinduksi oleh cekaman aluminium pada banyak tanaman. Diduga kedua gen ini terlibat dalam mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman aluminium. Tujuan penelitian ini adalah menguji ekspresi gen Gα dan GST kedelai kultivar Lumut yang mendapat cekaman aluminium. Kondisi cekaman dilakukan dengan menggunakan larutan hara. Cekaman yang diberikan yaitu pH 4 dan pH 4+1.6mM Al. Tanaman pada larutan hara pH 6 digunakan sebagai kontrol perlakuan. RNA total diisolasi dengan menggunakan kit Trizol dan sintesis cDNA dilakukan melalui transkriptase balik. Analisis ekspresi kedua gen tersebut dilakukan dengan menggunakan metode PCR. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen Gα dan GST diekspresikan tidak begitu berbeda pada tanaman yang diberi cekaman aluminium daripada pH 6 ataupun pH 4. Hal ini menunjukkan bahwa ekspresi gen Gαdan GST tidak terinduksi cekaman aluminium.
Kedelai (Glycine max (L). Merr) adalah salah satu bahan pangan penting bagi rakyat Indonesia. Kebutuhan kedelai dalam negeri rata-rata 2 juta ton/tahun, sedangkan produksi kedelai dalam negeri hanya 0.8 juta ton/tahun sehingga pemerintah harus mengimpor kedelai sebesar 1.2 juta ton setiap tahunnya (Atman 2006). Tingginya impor kedelai membuat pemerintah mencanangkan program bangkit kedelai.Implementasi program bangkit kedelai, akan ditempuh melalui 2 subprogram yaitu dengan intensifikasi, dan pengembangan kedelai pada lahan kering dan peningkatan Intensitas Pertanaman (IP) pada lahan seluas 500.000 ha selama 5 tahun.
Indonesia mempunyai tanah podzolik merah kuning (PMK) seluas 47.5 juta ha (CSAR 1997). Lahan ini dapat dimanfaatkan untuk peningkatan produksi kedelai nasional. Kendalanya adalah tanah podzolik merah kuning memiliki derajat keasaman yang tinggi dengan kelarutan Al yang tinggi sehingga menjadi faktor pembatas produksi tanaman karena Al merupakan racun bagi tanaman.
Pada tanah asam (pH < 5), Al menjadi oktahedral hexahidrat yang larut (Al3+) yang merupakan bentuk paling toksik bagi tanaman dengan gejala umumnya adalah pertumbuhan akar terhambat, akar menjadi pendek dan menebal khususnya akar utama (Ryan et al. 1993; Sasaki et al. 1994). Bagian ujung akar (tudung akar, meristem, zona perpanjangan akar) mengakumulasi Al lebih banyak dan paling mengalami kerusakan dibandingkan jaringan akar lainnya (Delhaize & Ryan 1995). Pada kedelai yang sensitif, cekaman Al menyebabkan penghambatan panjang akar yang signifikan (Lazof et al. 1994).
Pengembangan budidaya tanaman kedelai pada lahan asam dapat dilakukan dengan perbaikan kesuburan tanah melalui pengapuran, pemupukan dan pemberian bahan organik. Teknik perbaikan lahan ini mahal sehingga memberatkan petani. Alternatif terbaik untuk pengembangan kedelai di lahan asam adalah dengan menggunakan varietas kedelai yang toleran.
Penelitian untuk mendapatkan kultivar kedelai yang toleran terhadap tanah asam dan isolasi gen-gen yang ekspresinya diduga diinduksi oleh cekaman Al melalui penapisan differensial terhadap mRNA telah dilakukan. Anwar et al.
(2000) berhasil mengklon enam fragmen gen yang responsif terhadap cekaman Al pada kedelai kultivar Lumut yaitu gmali1 (menyandikan H+-ATPase membran plasma, gmali14 (menyandikan Histon H3), gmali20 (menyandikan katalase), gmali49 (menyandikan NADH dehydrogenase), gmali50 (menyandikan Auxin- induced Protein), dan sapali (menyandikan Aminoacyl Peptidase). Yuniati (2000) juga telah berhasil mengklon fragmen gen A36 dari kedelai kultivar Slamet yang toleran terhadap Al, dan diduga gen A36 menyandikan protein regulator pertumbuhan (Suharsono et al. 2003).
Analisis ekspresi gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada tanaman kedelai telah banyak dilakukan. Menurut Muzuni (2003) ekspresi gen gmali14 dan gen gmali50 pada kedelai kultivar Lumut spesifik diinduksi oleh Al. Pada kultivar yang peka terhadap cekaman aluminium yaitu kultivar Lumut, gen gmali50 memperlihatkan ekspresi tertinggi pada dosis aluminium lebih rendah dibandingkan pada kultivar yang toleran cekaman aluminium yaitu kultivar Slamet (Tistama 2003). Ekspresi gen G subunit α, GST8 dan GST12 pada kultivar Slamet diinduksi oleh cekaman aluminium (Mashuda 2007).
Pada kedelai terdapat dua kopi gen yang menyandikan protein heterotrimerik-Gα yaitu SGA1 (Kim et al. 1995) dan SGA2 (Gotor et al. 1996). Suharsono & Suharsono (2004) berhasil mengisolasi gen SGA1 dari kedelai kultivar Slamet dan Lumut. Analisis kesamaan terhadap urutan nukleotidanya
menunjukkan bahwa gen Gα yang diisolasi dari kedelai kultivar Lumut
mempunyai kemiripan 91% dengan SGA2 dari kedelai kultivar Williams,
sedangkan gen Gα dari kultivar Slamet mempunyai kemiripan dengan gen LlGA1 dari Lupinus luteus (Darlian 2005).
Protein G merupakan salah satu protein yang penting dalam komunikasi sel untuk menanggapi perubahan lingkungan. Lintasan signal transduksi terjadi karena adanya interaksi antara sinyal dan reseptor permukaan membran sehingga sinyal sampai ke protein heterotrimerik-G yang diikuti dengan perubahan GDP menjadi GTP. Protein heterotrimerik-G berfungsi menyampaikan informasi dari reseptor protein G yang teraktivasi ke efektor di bagian hilir dari suatu jalur sinyal. Protein G subunit α mengaktifkan phospholipase C (PLC) yang terletak pada membran plasma, PLC menghidrolisis phosphatidylinositol4,5-biphosphate
(PIP2) untuk menghasilkan dua second messenger yaitu inositol 1,4,5-
triphosphate (IP3) yang dilepaskan ke dalam sitoplasma dan diacylglycerol (DAG) yang tetap berada di membran, yang mengaktifkan protein kinase C (PKC) (Becker et al. 2002). IP3 dapat mengikat reseptor membran seperti kanal Ca2+, melepas Ca2+ke dalam sitosol sehingga level Ca2+ meningkat dan merubah fungsi
sel. Cekaman Al menghambat PLC, yang akhirnya akan menghambat PIP2
menjadi IP3 sehingga mengganggu Ca2+ di dalam sel (Jones & Kochian 1995). Protein heterotrimerik-G berperan dalam meregulasi ketahanan terhadap patogen (Blume et al. 2000; Beffa et al. 1995; Legendre et al. 1992) dengan meningkatkan Ca2+ sistolik dalam sel (Aharon et al. 1998) sehingga mengaktifkan lintasan signal downstream di dalam sel (Zimmerman et al. 1997). Protein G berperan dalam regulasi lintasan biosintesis benzo phenathridine alkaloid (Mahady et al. 1998), dan regulasi kanal K+ pada sel mesofil (Fairley-Grenot & Asmann 1991; Li & Asmann 1993).
Protein G subunit α terletak di membran plasma. Protein G berinteraksi dengan molekul reseptor yang ada di membran plasma (Fujisawa et al. 2001). Subunit α berperan dalam mengaktifkan kanal Ca2+ pada plasma membran tanaman tomat (Aharon et al. 1998), meningkatkan level IP3 pada tanaman kedelai (Legendre et al. 1993), meningkatkan spesies oksigen aktif (AOS) H2O2 pada kultur sel tanaman kedelai (Legendre et al. 1992), dan bertindak sebagai hulu dari GTPase Rac pada sistem pertahanan padi terhadap penyakit blas (Suharsono et al. 2002). Subunit α (RGA1) berperan dalam perkembangan normal ruas batang dan benih padi. Hal ini ditunjukkan oleh mutan Daikoku d1 yang mengalami mutasi pada RGA1 yang menyebabkan ketidaknormalan morfologi tanaman ini yaitu kerdil, benih kecil, dan daun berwarna hijau tua (Fujisawa et al. 1999).
Akhir dari jalur transduksi sinyal adalah mengarah ke pengaturan satu atau lebih aktivitas seluler ataupun pengaktifan beberapa gen spesifik untuk menanggapi sinyal dari luar. Terdapat lebih dari 20 jenis gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al dan telah diisolasi dari berbagai spesies tanaman, diantaranya yaitu Arabidopsis thaliana (Richard et al.1998) dan gandum (Triticum aestivum L.) (Richards et al. 1994). Pada Arabidopsis, gen GST (Gluthatione S-
Transferase) terekspresi sebagai respon ketahanan terhadap cekaman Al dan cekaman oksidatif (Ezaki et al. 2004). Protein GST tidak hanya terekspresi oleh cekaman Al tetapi juga oleh cekaman lain seperti cekaman garam (Roxas et al. 2000), patogen (Dean et al. 2005), dan cekaman osmotik (Galle et al. 2005). GST merupakan protein yang banyak terlibat dalam menanggapi berbagai cekaman kimia dan termasuk dalam golongan protein yang berhubungan dengan sistem antioksidasi (Ulmasov et al. 1995). Gen GST ada pada setiap tahap perkembangan tanaman dan ada pada setiap jaringan (McGonigle et al. 2000).
Pada kedelai, 25 jenis gen GST telah diindentifikasi dan dikelompokan berdasarkan kemiripan sekuennya yaitu GmGSTI, GmGSTII, dan GmGSTIII. GmGSTIII memiliki anggota paling banyak yaitu 20 jenis (GmGST1- GmGST20) dan diekspresikan paling besar yaitu 92%, GmGST8 diekspresikan secara melimpah yaitu sebesar 33% berdasarkan uji Expressed Sequence Taq (EST).
GmGSTI mempunyai 4 anggota (GmGST21-GmGST24) diekspresikan sebesar
6%, GmGSTII mempunyai 1 anggota yaitu GmGST25 diekspresikan sebesar 2%. GmGST5, GmGST8, GmGST12 dan GmGST13 terdapat di akar (McGonigle et al. 2000; Droog et al. 1995).
Penelitian mengenai ekspresi gen Gα dan GST (GST8 dan GST12) pada tanaman kedelai yang toleran tanah asam dan cekaman Al telah dilakukan oleh Mashuda (2007). Cekaman Al pada kedelai toleran menyebabkan meningkatnya ekspresi gen Gα, gen GST8, dan gen GST12. Ekspresi tertinggi gen Gα dan gen GST12 terjadi pada 8 jam setelah perlakuan dan gen GST8 pada 24 jam setelah perlakuan cekaman 1.6 mM Al. Untuk melihat ekspresi gen Gα dan GST secara lebih jelas, maka perlu untuk mengkaji ekspresi gen-gen ini pada tanaman kedelai yang peka terhadap tanah asam dan cekaman aluminium.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari ekspresi gen Gα dan GST pada kedelai kultivar Lumut yang mendapat cekaman Al.
Hipotesis Penelitian
Ekspresi gen Gα dan GST pada kedelai kultivar Lumut tidak terinduksi oleh cekaman Al.