BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Nukleus
Nukleus (Gambar 5) sering dikenal sebagai inti sel. Nukleus pertama kali dikenalkan oleh Brown pada tahun 1831 yang mengamati sel-sel tumbuhan. Struktur nukleus sel tumbuhan (eukariot) mempunyai inti sel yang jelas ketika diamati, karena bahan-bahan inti yang ada di dalam nukleus dibatasi oleh membran nukleus (karyotheca), yaitu struktur membran fosfolipid bilayer mirip dengan struktur membran plasma.28
Nukleus memiliki peran yang sangat penting dalam kehidupan sebuah sel. Peranan nukleus dalam hal ini adalah untuk mengatur dan mengontrol segala aktifitas kehidupan sel serta membawa informasi genetik yang diturunkan ke generasi berikutnya. Informasi genetik ini disimpan dalam suatu molekul polinukleutida yang disebut DNA (Deoxyribonucleic acid). DNA pada umumnya tersebar di dalam nukleus sebagai matriks seperti benang yang disebut kromatin. Ketika sel akan memulai membelah, kromatin akan berkondensasi membentuk struktur yang lebih padat dan memendek yang selanjutnya disebut kromosom. Kromosom tersusun atas molekul DNA dan protein histon. Struktur di dalam nukleus yang merupakan tempat berkonsentrasinya molekul DNA adalah nukleolus (anak inti.). Nukleolus berperan sebagai tempat terjadinya sintesis molekul RNA (Ribonucleic acid) dan ribosom. RNA merupakan hasil salinan DNA yang akan ditransfer ke sitoplasma untuk diterjemahkan menjadi rantai asam amino yang disebut protein.28
2.3.1 Nukleolus
Struktur nukleolus (anak inti) pada pengamatan mikroskop elektron terlihat sebagai sebuah atau lebih bangunan basofilyang berukuran lebih besar dari ukuran butir-butir kromatin.28
Nukleolus merupakan tempat berlangsungnya transkripsi gen, dimana molekul rRNA diproses. rRNA adalah salah satu jenis RNA yang merupakan materi penyusun ribosom. Molekul rRNA yang baru terbentuk, akan segera dikemas bersama protein ribosom untuk dikeluarkan dari inti sel. Transkripsimolekul rRNA di dalam nukleolus menjamin pembentukan molekul ribosom pada sitoplasm. Di dalam nukleolus, terdapat sejumlah potongan-potongan DNA (rDNA) yang ditranskripsi menjadi rRNA secara berulang-ulang, dan berlangsung cepat dengan bantuan enzim RNA polymerase I. Potongan-potongan DNA tersebut dinamakan nucleolar organizer. Kandungan RNA dalam nukleolus jika dibanding dengan bagian lain dari inti sel adalah tidak tetap, yaitu diperkirakan 5%-20%.28,29
2.3.2 Nucleolar Organizing Region (NOR)
Nucleolus organizer region (NOR) atau nucleolar organizer merupakan bagian kromosom dimana sekitarnya terjadi pembentukan nukleolus.14 Nukleolus organizer regions (NORs) adalah segmen kromosom dienkripsi untuk RNA ribosom (rRNA) yang hadir pada loop spesifik DNA. NOR telah menerima banyak perhatian baru-baru ini karena dari pengamatan didapati bahwa frekuensi NOR dalam inti secara signifikan lebih tinggi dalam sel-sel ganas berbanding sel normal, sel reaktif atau sel neoplastik jinak sehingga merupakan nilai diagnostik dalam karakterisasi invasi pada karsinoma. NOR juga berperan dalam estimasi aktivitas selular yang diterapkan pada berbagai lesi neoplastik atau hiperplastik.30 Daerah ini merupakan bagian tertentu dari kromosom yang berhubungan dengan nukleolus setelah nukleus membagi dan berisi beberapa salinan tandem gen DNA ribosom. Pada manusia, NOR mengandung gen 5.8S, 18S, 28S rRNA yang berkerumun di lengan pendek kromosom 13, 14, 15, 21 dan 22 (kromosom akrosentrik).14,30 NOR adalah gen yang mengkode prekursor dari tiga ribosomal RNA terbesar (18S, 5.8S dan 25S pada tanaman). NOR termasuk gen
aktif rRNA, yang menimbulkan konstriksi sekunder kromosom metafase. Pada metafase, sisa protein dari nukleolus sering terkait dengan konstriksi sekunder. Setiap gen rRNA pada NOR hampir identik secara berurutan, meskipun bervariasi dalam ukuran karena perbedaan jumlah elemen DNA ulangan dalam bagian ruangan intergenik umum.32
Dalam komplemen kromosom lengkap selalu ada enam kromosom dengan terminal nucleolus organizing region (NOR). Dalam kebanyakan kasus, bagian dari NOR adalah decondensed, dan dari beberapa bagian decondensed ini dibentuk bersama-sama menjadi nukleolus besar. Nukleolus besar ini mudah terlihat dalam fase kontras bahkan tanpa pra-perawatan karena struktur khusus dan ukuran besarnya. Bentuk nukleolus berkisar dari membulat ke irregular. Selain pembentukan nukleolus dari enam NOR ini, ada juga beberapa nukleolus yang lebih kecil terdiri dari NOR hanya dua sampai lima nucleolus organizing kromosom.30,33 Nucleolus organizer region (NOR) dapat diidentifikasi melalui teknik argyrofilik (AgNOR) melalui proses rutin fiksasi formalin parafin.14
NORs juga mengandung zat asam, dan protein non-histon yang mengikat ion perak dan dapat dilihat secara selektif dengan metode perak pada sampel sito-histologi. NORs yang dihubungkan dengan protein argyrofilik apabila diwarnakan dengan perak disebut sebagai “AgNOR”. Sifat biokimia yang tepat dari protein ini belum didefinisikan, tetapi telah diketahui sebagai B 23, C 23 dan RNA polymerase dan dikaitkan dengan asam, unsur non-histon.30 Pada mikroskop cahaya, protein AgNOR dapat terlihat sebagai titik-titik hitam yang terletak di dalam nukleolus.14,30 NORs banyak menarik perhatian karena frekuensi muncul pada sel ganas lebih tinggi daripada sel normal, reaktif atau sel neoplastik jinak.31
2.3.3 Nucleophosmin dan Alternative Reading Frame (ARF)
Nucleophosmin (NPM) atau B23 merupakan sebuah fosfoprotein nukleolar dalam pengolahan rRNA dan juga merupakan salah satu protein argyrofilik dari AgNORs. NPM terlibat dalam mengendalikan pertumbuhan sel, diferensiasi sel dan merupakan program kematian sel. NPM yang berlebihan ekspresi dapat berkontribusi
dalam timbulnya kanker. NPM berperan dalam biogenesis ribosom, dimana fosforilasi dan modifikasi NPM oleh cyclin E - CDK2 holoenzyme diperlukan untuk duplikasi sentrosom dan replikasi DNA. NPM merupakan onkogen kuat dan menyebabkan translokasi kromosom pada leukemia myeloid akut.12,13
ARF merupakan protein yang berperan sebagai gen penekan tumor dalam nukleolar. Laporan terbaru dari Sherr, Roussel dan Yanping Zhang menunjukkan bahwa NPM dan ARF berinteraksi secara langsung dalam nukleolus. Laporan data juga menunjukkan NPM nucleocytoplasmic merupakan kunci utama dalam mempromosi proliferasi sel. Pengolahan rRNA dipengaruhi oleh pembentukan kompleks ARF - NPM dalam nukleolus. ARF berinteraksi dengan protein argyrofilik nucleolar untuk mencegah produksi ribosom dan tumorigenesis, serta menggarisbawahi potensi onkogenik pada nukleolus.12
Protein shuttling di antara nukleus dan sitoplasma merupakan kunci mekanisme dalam memastikan perkembangan siklus sel yang tepat. Dalam penelitian sebelumnya, NPM telah diidentifikasi sebagai target p53-independen novel oleh protein penekan tumor ARF. Dalam menanggapi sinyal hiperproliferatif karena NPM, nukleolar ARF mengikat NPM secara efektif dalam menghambat shuttling nucleocytoplasmic NPM.13 Tanpa sebuah checkpoint ARF utuh, protein nukleolus seperti NPM dapat berubah dan menyebabkan tumorigenesis melalui berbagai fungsi nukleolarnya.12
2.3.4 Perwarnaan AgNOR
Pemeriksaan kanker pada saat ini banyak dilakukan dengan mengamati proliferasi dan apoptosis sel. Proliferasi sel dapat dipelajari secara baik dengan metode “flow-sitometri” atau pelabelan radioisotop dengan Ki-67, PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) dan teknik pewarnaan seperti AgNORs. Metode AgNOR ini dapat digunakan dalam mengevaluasi morfologi dan kinetika sel, dan merupakan parameter yang digunakan dalam menilai respon radiasi melalui hasil histopatologi.31
Pewarnaan AgNOR (prosedurnya dirujuk pada muka surat 32) ini dengan mudah dapat dilakukan pada jaringan yang difiksasi dengan formalin, dan digunakan untuk mengevaluasi morfologi dan kinetika sel dalam biopsi dengan ukuran yang kecil.16 Marker kanker AgNORs dapat digunakan untuk melakukan pemeriksaan proliferasi melalui bercak AgNORs pada daerah inti atau “Nucleolar Organizer Regions” (NORs) lengkung DNA ribosom yang ditranskripsikan menjadi RNA ribosomal dengan bantuan RNA polymerase.31
Pengamatan sejumlah parameter AgNOR (jumlah, ukuran dan distibusi) dapat digunakan dalam patologi sel kanker untuk kepentingan diagnostik maupun prognostik.Jumlah, ukuran dan distribusi AgNOR dalam nukleus dapat digunakan untuk memdeteksi dan memprediksi prognosis sejumlah neoplasia, seperti kandung kemih, karsinoma faring, dan lesi pada kulit.16,31AgNOR diamati dengan mikroskop cahaya sebagai titik-titik hitam. Pengamatan AgNOR secara kuantifikasi dan kualitatif lebih tepat dengan menggunakan metode morfometrik, dimana AgNORnya diperbesarkan dengan skala geometrik tertentu sehingga gambarannya kelihatan lebih jelas.19
Penelitian menunjukkan AgNOR dapat digunakan untuk menunjukkan adanya aktifitas biologis pada karsinoma sel skuamosa. AgNOR juga digunakan pada oral submukus fibrosis untuk memperkirakan perilaku biologis oral submukus fibrosis, yang dapat dihubungkan dengan gradasi histologi klinis. Ketertarikan para ahli pada protein AgNOR meningkat sekitar tahun 1980-an diikuti dengan observasi bahwa sel ganas memiliki jumlah AgNOR yang lebih tinggi dibandingkan dengan sel yang jinak atau sel normal.34 Pada penelitian Salehinejad, dkk. (2007), sel ganas menunjukkan jumlah AgNOR yang lebih banyak dan bentuk tidak beraturan, sedangkan sel jinak memiliki AgNOR yang lebih sedikit dengan bentuk yang teratur.35 Pada sel normal, hanya satu atau dua titik AgNOR yang dilihat sebagai titik-titik yang padat. Bagi sel-sel normal (Gambar 6) yang semakin bergerak menuju ke sel-sel displastik dan sel-sel-sel-sel ganas, jumlah DNA semakin meningkat berserta dengan peningkatan jumlah titik AgNOR. Sel-sel ganas mempunyai derajat diferensiasi yang berlainan yang dimana mempunyai nilai AgNOR yang berbeda. AgNOR yang ditemukan pada sel ganas
diferensiasi baik (Gambar 7) mempunyai nilai AgNOR yang rendah dibanding dengan sel ganas yang diferensiasinya sedang (Gambar 8), buruk (Gambar 9) atau undifferentiated (Gambar 10). Ini karena derajat diferensiasi secara umum berhubungan dengan tingkat keganasan dan proliferasi sel, sehingga tumor yang derajat diferensiasinya buruk akan mempunyai tingkat proliferasi yang lebih tinggi yang tercermin dari nilai AgNOR yang lebih tinggi.36,37,38 Saat ini, berbagai studi dilakukan untuk mengetahui kemungkinan menemukan penanda keganasan dari titik-titik AgNOR. Hal ini dilakukan karena teknik ini mudah dilakukan, murah, cepat dan menghasilkan informasi yang akurat tentang perkembangan keganasan.35
Gambar 6. Gambaran mikroskopis mukosa normal rongga mulut
dengan pewarnaan AgNOR (100X). Anak panah biru menunjukkan titik hitam AgNOR.38
Gambar 7. Gambaran mikroskopis karsinoma sel skuamous (KSS) rongga mulut berdiferensiasi baik dengan NORs yang sedikit terdapat pada inti (1000X). Anak panah biru menunjukkan titik hitam AgNOR.38
Gambar 8. Gambaran mikroskopis karsinoma sel skuamousa (KSS) rongga mulut berdiferensiasi sedang dengan sebagian ukuran NORs pada inti yang beragam (1000X). Anak panah biru menunjukkan titik hitam AgNOR.38
Gambar 9. Gambaran mikroskopis karsinoma sel skuamous (KSS) rongga mulut berdiferensiasi buruk dengan jumlah NORs yang banyak dan beragam pada inti (1000X). Anak panah biru menunjukkan titik hitam AgNOR.38
Gambar 10. Gambaran mikroskopis karsinoma sel skuamous (KSS) rongga mulut tidak berdiferensiasi (undifferentiated) dengan jumlah NORs yang banyak dan berkelompok pada inti (1000X). Anak panah biru menunjukkan titik
Perbaikan DNA berhasil (reversible)