BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Optimasi Metode
4. Optimasi fase gerak
Sistem kromatografi yang digunakan dalam penelitian ini merupakan kromatografi partisi fase terbalik yaitu fase gerak yang lebih polar dari pada fase diam. Kolom yang digunakan adalah Kromasil-C18 berukuran 250 x 4,6 mm i.d., 5µm, sedangkan fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol dan
aquabides yang bersifat lebih polar dari pada fase diam yang digunakan. Pada tahap optimasi fase gerak digunakan flow rate yang sama untuk setiap komposisi fase gerak yang dioptimasi sehingga bila ada perbedaan pada hasil yang diperoleh maka perbedaan tersebut dapat disimpulkan karena perbedaan komposisi fase gerak yang digunakan. Nilai flow rate yang digunakan adalah 2 ml/menit, hal ini bertujuan untuk mempercepat waktu elusi dari kedua senyawa yang akan ditetapkan.
Fase gerak yang dioptimasi adalah metanol dan aquabides dengan berbagai perbandingan komposisi yaitu 55 : 45; 60 : 40; 65 : 35 dan 70 : 30 (v/v). Fase gerak yang telah dibuat terlebih dahulu disaring dengan penyaring Whattman anorganik untuk menyaring partikel yang dapat menyumbat kolom. Selanjutnya fase gerak dideggasing dengan menggunakan ultrasonicator untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat mengganggu pemisahan sampel.
Pemilihan komposisi fase gerak tersebut didasarkan pada penelitan sebelumnya yang dilakukan oleh Li X (1998) yaitu penetapan kadar hidrokortison dan kloramfenikol dalam tetes telinga, dalam penelitian tersebut dikatakan bahwa fase gerak yang optimal adalah metanol : aquabides dengan perbandingan 60 : 40. Penelitian ini dilakukan optimasi pada komposisi fase gerak yang tidak terlalu berbeda dengan penelitian Li X (1998) karena baik hidrokortison asetat maupun hidrokortison memiliki struktur yang hampir sama sehingga interaksi kedua senyawa tersebut dengan fase gerak dan fase diam juga akan mirip. Berikut ini adalah struktur kedua senyawa tersebut (Gambar 19):
Gambar 19. Struktur hidrokortison (a) dan hidrokortison asetat (b)
Pada proses optimasi fase gerak ini menggunakan sampel yang telah dipreparasi dengan tujuan agar hasil optimasi ini dapat langsung digunakan pada penetapan kadar sampel karena dalam sampel tidak hanya mengandung hidrokortison asetat dan kloramfenikol murni namun terdapat senyawa lainnya. Dalam proses ekstraksi mungkin senyawa lain tersebut ikut terekstraksi karena memiliki sifat yang hampir sama (dalam hal kelarutannya) dengan hidrokortison asetat dan kloramfenikol sehingga akan menyebabkan peak yang saling
overlapping. Hal ini dapat dilihat dari peak kloramfenikol yang selalu diikuti oleh
peak lain. Oleh karena itu optimasi dilakukan juga mempertimbangkan nilai resolusi peak kloramfenikol dan peak senyawa lain tersebut.
Tahap optimasi pertama yang dilakukan adalah menggunakan komposisi fase gerak metanol : aquabides 55 : 45 (v/v). Hasil optimasi menggunakan fase gerak ini dapat dilihat pada gambar 17 (hlm 40). Pada kromatogram tersebut dapat dilihat bahwa waktu retensi kloramfenikol adalah 3,872 menit dan hidrokortison asetat adalah 17,233 menit. Oleh karena itu, pengunaan fase gerak dengan
komposisi metanol : aquabides (55 : 45) v/v ini tidak efisien karena waktu elusi yang diperlukan sangat lama.
Tahap optimasi kedua adalah menggunakan fase gerak metanol : aquabides (60 : 40) v/v. Pada fase gerak ini, jumlah metanol yang digunakan ditambah untuk meningkatkan eluent strength fase gerak. Peningkatan eluent strength ini diharapkan akan meningkatkan kemampuan fase gerak untuk mengelusi analit lebih cepat sehingga waktu retensi analit juga akan semakin pendek. Hasil dari optimasi ini dapat dilihat pada kromatogram (Gambar 20) di bawah ini:
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (60 : 40 v/v)
Flow rate : 2 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Gambar 20. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap kedua
Pada gambar di atas (Gambar 20) peak nomor 9 adalah kloramfenikol dengan waktu retensi 3,084 menit dan peak nomor 16 adalah hidrokortison asetat dengan waktu retensi 10,070 menit. Penggunaan fase gerak ini dari segi waktu
elusi lebih efisien dari pada fase gerak sebelumnya, namun pada kondisi ini tekanan kolom sebesar 300 atm, kondisi ini tidak diinginkan karena tekanan kolom yang terlalu tinggi ini akan merusak kolom yang digunakan serta menurunkan realibilitas dari sistem KCKT yang digunakan. Tekanan kolom yang diinginkan adalah tidak lebih dari 197,4 atm (Snyder et al., 1997). Oleh karena itu, dalam optimasi selanjutnya dilakukan penurunan flow rate yang digunakan, dengan menurunnya flow rate maka tekanan kolom juga akan menurun tetapi waktu retensi juga akan semakin lama sehingga akan memperpanjang waktu elusi. Hasil penurunan flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40) v/v dapat dilihat pada tabel III dibawah ini:
Tabel III. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40)
Flow rate (ml/menit) Lempeng teoritis (N) HETP (10-3) Resolusi klor dengan senyawa lain Waktu retensi (menit) Pressure (atm) Klor HCA 1,9 5748,54 4,35 2,29 4,397 14,769 279 1,8 6017,19 4,15 2,23 4,632 15,374 267 1,7 8900,29 2,80 2,36 5,096 16,413 253 *Klor = Kloramfenikol HCA = Hidrokortison asetat
Dari hasil tersebut (Tabel III) dapat diamati bahwa pada penurunan flow rate hingga 1,7 ml/menit tekanan kolom nilainya lebih dari 197,4 atm dan waktu retensi hidrokortison asetat (HCA) adalah 16,413 menit (contoh perhitungan N, HETP dan Rs dapat dilihat pada lampiran 5). Dengan demikian, fase gerak ini disimpulkan tidak efisien karena memerlukan waktu elusi yang panjang. Kromatogram hasil penurunan flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 :40 v/v) dapat dilihat pada lampiran 6.
Tahap optimasi ketiga adalah menggunakan komposisi fase gerak metanol : aquabides dengan perbandingan 65 : 35 v/v. Jumlah metanol dalam fase gerak ini ditingkatkan agar waktu elusi dapat lebih singkat. Hasil kromatogram dari optimasi fase gerak ini dapat dilihat pada kromatogram (Gambar 21) di bawah ini:
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)
Flow rate : 2 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Gambar 21. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap ketiga
Pada gambar 21 peak nomor 7 adalah kloramfenikol dengan waktu retensi 2,342 menit dan peak nomor 14 adalah hidrokortison asetat dengan waktu retensi 5,967 menit dan tekanan kolom pada kondisi tersebut sebesar 233 atm. Pada kondisi ini tekanan kolom berada di atas 197,4 atm, sehingga langkah selanjutnya yang ditempuh untuk menurunkan tekanan tersebut adalah dengan menurunkan
Tahap optimasi fase gerak keempat (terakhir) adalah metanol : aquabides dengan perbandingan 70 : 30 v/v. Fase gerak ini mengandung jumlah metanol terbanyak dari fase gerak yang telah dioptimasi sebelumnya, dengan demikian kemampuan mengelusi fase gerak ini lebih besar dari fase gerak sebelumnya. Hasil yang diharapkan dari penggunaan fase gerak ini adalah mendapatkan waktu elusi yang lebih singkat daripada sebelumnya. Hasil kromatogram (Gambar 22) yang didapat adalah sebagai berikut:
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)
Flow rate : 2 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Gambar 22. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap keempat
Pada kromatogram tersebut (Gambar 22) dapat diamati bahwa peak
kloramfenikol (6) sangat dekat dengan peak nomor 7 dan peak hidrokortison asetat (12) tidak memisah dengan sempurna dari peak lainnya. Solusi yang ditempuh agar pemisahan kedua senyawa tersebut lebih baik adalah dengan menurunkan flow rate yang hasilnya dapat dilihat dari kromatogram dibawah ini (Gambar 23 – 27):
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)
Flow rate : 1,8 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Gambar 23. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,8 ml/menit
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)
Flow rate : 1,6 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)
Flow rate : 1,4 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Gambar 25. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,4 ml/menit
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)
Flow rate : 1,2 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD
Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)
Flow rate : 1,0 ml/menit
Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm
Gambar 27. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,0 ml/menit Hasil yang diperoleh menunjukkan penurunan flow rate tidak dapat mengatasi permasalahan yang ada. Hal ini dapat dilihat dari kromatogram (Gambar 27) peak hidrokortison asetat (14) tidak memisah dengan peak lainnya, oleh karena itu tidak dilanjutkan penurunan flow rate lebih kecil karena akan memperpanjang waktu elusi.
Dari keseluruhan optimasi fase gerak dengan flow rate 2 ml/menit maka disimpulkan bahwa fase gerak metanol : aquabides dengan perbandingan 65 : 35 v/v (Gambar 21) adalah yang optimal dilihat dari segi waktu retensi, tekanan kolom, resolusi dan nilai HETP, rangkuman hasil optimasi fase gerak secara keseluruhan dapat dilihat dari tabel IV di bawah ini:
Tabel IV. Hasil optimasi komposisi fase gerak pada flow rate 2 ml/menit Komposisi Lempeng teoritis (N) HETP (L/N) 10-3 Resolusi klor dengan senyawa lain Waktu rentensi (menit) Pressure (atm)
Met Aq Klor HCA
55 45 5479,46 4,56 2,12 3,871 > 15 271
60 40 4770,16 5,24 2,04 3,084 10,070 300
65 35 3836,22 6,52 1,68 2,342 5,967 223
70 30 HCA belum memisah dengan senyawa lain dalam sampel
*Met: metanol Klor: kloramfenikol Aq: aquabides
HCA: Hidrokortison asetat
Dari tabel IV di atas dapat diamati nilai HETP dari fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) adalah yang terbesar, sedangkan menurut Van Deemter nilai HETP yang baik adalah yang paling kecil selain itu nilai resolusi yang dihasilkan juga tidak memenuhi syarat Rs ≥ 2 (Snyder et al., 1997) namun fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) tetap dipilih karena dilihat dari segi waktu retensi dan tekanan kolom yang lebih efisien sedangkan untuk nilai resolusi dapat ditingkatkan dengan penurunan flow rate yang digunakan. Hasil optimasi flow rate fase gerak tersebut dapat dilihat pada tabel V dan kromatogram hasil optimasi fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) dapat dilihat pada lampiran 7.
Tabel V. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (65 : 35)
Flow rate (ml/menit) Lempeng teoritis (N) HETP (10-3) Resolusi klor dengan senyawa lain Waktu retensi (menit) Pressure (atm) Klor HCA 0,4 7822,13 3,20 2,42 9,920 >20 62 0,5 9132,64 2,74 2,33 8,031 19,202 78 0,6 8709,49 2,87 2,28 6,681 15,921 93 0,7 6812,60 3,67 2,16 5,737 13,663 109 1,0 5994,57 4,17 2,09 5,223 12,727 129 1,1 5895,70 4,24 2,02 4,740 11,563 156 1,2 5376,96 4,65 2,16 3,488 8,593 188 1,3 4642,82 5,38 1,83 3,243 7,984 207 1,4 4537,02 5,51 1,81 3,022 7,455 220 *Klor: kloramfenikol HCA: hidrokortison asetat
Hasil optimasi flow rate bila digambarkan dalam bentuk kurva adalah sebagai berikut (Gambar 28):
Gambar 28. Kurva flow rate vs HETP dengan fase gerak metnanol : aquabides (65 : 35) Kurva di atas (Gambar 28) menunjukkan bahwa dengan peningkatan flow rate tidak selalu meningkatkan nilai HETP namun terdapat suatu kecepatan alir optimum yang dapat menghasilkan nilai HETP terkecil hal ini sesuai dengan teori Van Deemter yang ditunjukkan melalui kurva sebagai berikut:
Gambar 29. Kurva teori Van Deemter 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 H E TP ( 10 -3)
flow rate fase gerak metanol : aquabides 65 :35 v/v (ml/menit)
Dari tabel V dapat diamati bahwa nilai HETP yang paling kecil pada flow rate 0,5 ml/menit. Namun flow rate tersebut tidak dipilih sebagai kondisi optimum karena dari sisi waktu elusi tidak efisien. Flow rate yang dipilih adalah 1,2 ml/menit karena memiliki nilai HETP yang cukup kecil, resolusi yang memenuhi syarat, waktu elusi yang efisien dan tekanan kolom yang diinginkan (kurang dari 197,4 atm).
B. Verifikasi Sistem KCKT Hasil Optimasi
Verifikasi sistem KCKT ini berfungsi untuk mengetahui sistem KCKT siap untuk digunakan atau tidak dan untuk memperoleh data yang reprodusibel pada saat analisis. Beberapa uji yang dilakukan untuk menguji kesiapan sistem yang dilakukan antara lain verifikasi sistem injeksi, uji kesesuaian sistem dan verifikasi akurasi pompa.
1. Verifikasi sistem injeksi
Verifikasi sistem injeksi yang dilakukan pada penelitian ini adalah ketelitian injeksi. Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan suatu injektor untuk menggambarkan jumlah yang sama dari suatu sampel yang diinjeksikan secara berulang. Parameter yang digunakan untuk menilai ketelitian injektor adalah nilai CV dari respon (AUC dan tinggi peak) 10 kali hasil injeksi baku dengan konsentrasi yang sama. Nilai CV yang memenuhi syarat adalah ≤ 1,0 % (Snyder, 1997). Hasil penetapan presisi injeksi dapat dilihat dari tabel VI dan