METODE PENELITIAN
3.4 Optimasi Pelarut
Dilakukan optimasi dengan mengukur serapan yang dihasilkan oleh RFP, INH dan PRZ dalam pelarut metanol dan campuran metanol dapar fosfat pH 5 dan pH 6.
3.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Rifampisin
Ditimbang RFP sebanyak 50 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL, dicukupkan volume dengan pelarut hingga garis tanda (1000 µg/mL) (LIB I), kemudian dipipet 2,5 mL dari LIB I kedalam labu ukur 25 mL dan ditambah pelarut hingga garis tanda (100 µg/mL) (LIB II).
3.4.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Isoniazid
Ditimbang INH sebanyak 50 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL, dicukupkan volume dengan pelarut hingga garis tanda (1000 µg/mL) (LIB I), kemudian dipipet 2,5 mL dari LIB I kedalam labu ukur 25 mL dan ditambah pelarut hingga garis tanda (100 µg/mL) (LIB II).
3.4.3 Pembuatan Larutan Induk Baku Pirazinamid
Ditimbang PRZ sebanyak 50 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL, dicukupkan volume dengan pelarut hingga garis tanda (1000 µg/mL) (LIB I), kemudian dipipet 2,5 mL dari LIB I kedalam labu ukur 25 mL dan ditambah pelarut hingga garis tanda (100 µg/mL) (LIB II).
3.4.4 Pembuatan Spektrum Serapan Rifampisin
Dipipet masing-masing 0,6; 0,9; 1,2; 1,5; 1,8 mL dari LIB II kedalam labu ukur 10 mL, kemudian dicukupkan volumenya dengan menggunakan pelarut sampai garis tanda untuk mendapatkan larutan RFP konsentrasi 6; 9;
12; 15; 18 µg/mL secara berturut-turut. Dari larutan-larutan tersebut dibuat spektrum serapannya.
3.4.5 Pembuatan Spektrum Serapan Isoniazid
Dipipet masing-masing 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL dari LIB II kedalam labu ukur 10 mL, kemudian dicukupkan volumenya dengan menggunakan pelarut sampai garis tanda untuk mendapatkan larutan INH konsentrasi 5; 7,5; 10; 12,5;
15 µg/mL secara berturut-turut. Dari larutan-larutan tersebut dibuat spektrum serapannya.
3.4.6 Pembuatan Spektrum Serapan Pirazinamid
Dipipet masing-masing 0,6; 0,75; 0,9; 1,05; 1,2 mL dari LIB II kedalam labu ukur 10 mL, kemudian dicukupkan volumenya dengan menggunakan pelarut sampai garis tanda untuk mendapatkan larutan PRZ konsentrasi 6; 7,5;
9; 10,5; 12 µg/mL secara berturut-turut. Dari larutan-larutan tersebut dibuat spektrum serapannya.
3.4.7 Pembuatan Spektrum Serapan Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid
Dibuat larutan campuran RFP, INH dan PRZ dengan cara dipipet RFP 1,2 mL LIB II, 1,0 mL LIB II INH dan 0,9 mL LIB II PRZ kedalam labu ukur 10 mL, kemudian dicukupkan volumenya menggunakan pelarut sampai garis tanda untuk mendapatkan larutan yang mengandung campuran RFP, INH dan PRZ dengan konsentrasi 12, 10 dan 9 µg/mL secara berurutan. Dari larutan tersebut dibuat spektrum serapannya.
3.4.8 Pembuatan Spektrum Serapan dengan Metode Ratio Absorbance (RA) untuk Penentuan Panjang Gelombang Isoabsorpsi dan Panjang Gelombang Maksimum Terpilih
Kurva ini dibuat dengan cara mengamati tumpang tindih spektrum masing – masing zat dan pelarut, diamati titik perpotongan antara spektrum tersebut. Dari kurva tersebut dapat ditentukan panjang gelombang isoabsorpsi (panjang gelombang dimana salah satu zat selisih serapannya sama dengan nol = titik isosbestik) dan panjang gelombang maksimum terpilih (panjang gelombang maksimum tertinggi dari ketiga zat). Dalam penelitian ini untuk menentukan panjang gelombang pada titik isoabsorpsi melakukan tumpang tindih spektrum RFP 12 µg/mL, INH 10 µg/mL dan PRZ 10,5 µg/mL dalam pelarut metanol sedangkan dalam pelarut metanol
dapar fosfat pH 6 tumpang tindih pada spekrum RFP 15 µg/mL, INH 10 µg/mL dan PRZ 10,5 µg/mL, kemudian ditentukan konsentrasi obat dengan double divisor.
3.4.9 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Ratio Absorbance (RA) Rifampisin
Nilai RA pada panjang gelombang maksimum dan panjang gelombang isoabsorpsi yang diperoleh, dihitung dan diplot dengan konsentrasi untuk mendapatkan persamaan garis regresinya.
3.4.10 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Ratio Absorbance (RA) Isoniazid Nilai RA pada panjang gelombang maksimum dan panjang gelombang isoabsorpsi yang diperoleh, dihitung dan diplot dengan konsentrasi untuk mendapatkan persamaan garis regresinya.
3.4.11 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Ratio Absorbance (RA) Pirazinamid
Nilai RA pada panjang gelombang maksimum dan panjang gelombang isoabsorpsi yang diperoleh, dihitung dan diplot dengan konsentrasi untuk mendapatkan persamaan garis regresinya.
3.4.12 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Rifampisin untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol
Penentuan panjang gelombang analisis RFP, dicari λ pada spektrum RFP dengan berbagai konsentrasi (6; 9; 12; 15; 18 µg/mL) pada rentang panjang gelombang 248 nm – 258 nm memberikan hubungan linieritas terbaik antara konsentrasi dengan nilai AUC, yang ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (nilai r ≤ 1) mendekati satu (Sangeetha et al., 2017).
3.4.13 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Isoniazid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol
Penentuan panjang gelombang analisis INH, dicari λ pada spektrum INH dengan berbagai konsentrasi (5; 7,5; 10; 12,5; 15 µg/mL) pada rentang panjang gelombang 260,2 nm – 270,2 nm memberikan hubungan linieritas terbaik antara konsentrasi dengan nilai AUC, yang ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (nilai r ≤ 1) mendekati satu (Sangeetha et al., 2017).
3.4.14 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Pirazinamid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol Penentuan panjang gelombang analisis PRZ, dicari λ pada spektrum PRZ dengan berbagai konsentrasi (6; 7,5; 9; 10,5; 12 µg/mL) pada rentang panjang gelombang 271,8 nm – 281,8 nm memberikan hubungan linieritas terbaik antara konsentrasi dan nilai AUC, yang ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (nilai r ≤ 1) mendekati satu (Sangeetha et al., 2017).
3.4.15 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Rifampisin untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6
Penentuan panjang gelombang analisis RFP, dicari λ pada spektrum RFP dengan berbagai konsentrasi (6; 9; 12; 15; 18 µg/mL) pada rentang panjang gelombang 248,8 nm – 258,8 nm memberikan hubungan linieritas terbaik antara konsentrasi dengan nilai AUC, yang ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (nilai r ≤ 1) mendekati satu (Sangeetha et al., 2017).
3.4.16 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Isoniazid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6
Penentuan panjang gelombang analisis INH, dicari λ pada spektrum INH dengan berbagai konsentrasi (5; 7,5; 10; 12,5; 15 µg/mL) pada rentang panjang
gelombang 261,2 nm – 271,2 nm memberikan hubungan linieritas terbaik antara konsentrasi dengan nilai AUC, yang ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (nilai r ≤ 1) mendekati satu (Sangeetha et al., 2017).
3.4.17 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Pirazinamid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6
Penentuan panjang gelombang analisis PRZ, dicari λ pada spektrum PRZ dengan berbagai konsentrasi (6; 7,5; 9; 10,5; 12 µg/mL) pada rentang panjang gelombang 272,8 nm – 282,8 nm memberikan hubungan linieritas terbaik antara konsentrasi dan nilai AUC, yang ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (nilai r ≤ 1) mendekati satu (Sangeetha et al., 2017).
3.4.18 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Area Under Curve (AUC) Rifampisin
Nilai AUC RFP dari berbagai konsentrasi yang dihasilkan dari spektrum serapan pada λ yang diperoleh, dihitung dan diplot untuk mendapatkan persamaan garis regresi (Sangeetha et al., 2017).
3.4.19 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Area Under Curve (AUC) Isoniazid
Nilai AUC INH dari berbagai konsentrasi yang dihasilkan dari spektrum serapan pada λ yang diperoleh, dihitung dan diplot untuk mendapatkan persamaan garis regresi (Sangeetha et al., 2017).
3.4.20 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Area Under Curve (AUC) Pirazinamid
Nilai AUC PRZ dari berbagai konsentrasi yang dihasilkan dari spektrum serapan pada λ yang diperoleh, dihitung dan diplot untuk mendapatkan persamaan garis regresi (Sangeetha et al., 2016).
3.5 Penetapan Kadar Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid