Diajukan untuk muniversitas Sumatera Uta OLEH: MAHATIR MUHAMMAD NIM

TESIS

ANALISIS SECARA SIMULTAN KANDUNGAN RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN PIRAZINAMID DALAM SEDIAAN TABLET SECARA SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET DENGAN

METODE RATIO ABSORBANCE DAN AREA UNDER CURVE

Diajukan untuk mUniversitas Sumatera Uta

OLEH:

MAHATIR MUHAMMAD NIM 167014029

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2019

ANALISIS SECARA SIMULTAN KANDUNGAN RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN PIRAZINAMID DALAM SEDIAAN TABLET SECARA SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET DENGAN

METODE RATIO ABSORBANCE DAN AREA UNDER CURVE TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

Diajukan untuk mUniversitas Sumatera Uta

OLEH:

MAHATIR MUHAMMAD NIM 167014029

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2019

PERSETUJUAN TESIS Nama Mahasiswa : Mahatir Muhammad Nomor Induk Mahasiswa : 167014029

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Analisis secara Simultan Kandungan Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet secara Spektrofotometri Ultraviolet dengan Metode Ratio Absorbance dan Area Under Curve

Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan TIM Penguji pada hari Jumat tanggal delapan bulan Feburari tahun dua ribu sembilan belas

Menyetujui :

Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Muchlisyam, M.Si., Apt

Anggota Tim Penguji : Prof. Dr. rer. Nat. E. De. Lux Putra, SU., Apt Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim,

Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT, karena atas berkat rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul

“Analisis secara Simultan Kandungan Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet secara Spektrofotometri Ultraviolet dengan Metode Ratio Absorbance dan Area Under Curve”. Shalawat dan salam untuk Rasulullah Muhammad SAW sebagai suri tauladan dalam kehidupan.

Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini, penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak baik moril maupun materil, Untuk itu penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Rektor Prof. Dr. Runtung, S.H., M.Hum., selaku Rektor Universitas Sumatera Utara, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas kepada penulis untuk mengikuti Program Studi Magister.

2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, yang telah menyediakan fasilitas kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister di Fakultas Farmasi.

3. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., selaku Ketua Program Studi Magister Farmasi dan Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Sc., Apt., selaku Sekretaris Program Studi Magister Farmasi yang telah banyak memberikan motivasi dan bimbingan sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan ini.

4. Bapak Prof. Dr. Muchlisyam, M.Si, Apt., dan Bapak Prof. Dr. rer.nat. Efffendy De Lux Putra, SU., Apt., selaku ketua dan anggota komisi pembimbing yang telah banyak membantu memberikan saran, koreksi dan bimbingan kepada penulis dalam menyelesaikan tesis ini.

5. Ibu Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt., dan Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku ketua dan anggota komisi penguji yang telah banyak memberikan saran dan koreksi kepada penulis dalam menyelesaikan tesis ini.

6. Bapak dan Ibu staf pengajar Program Studi Magister Farmasi atas bimbingannya selama penulis menjalani pendidikan.

7. Ayahanda Dr.H. Ali Akbar Ibunda Hj. Tinur Masitho, yang telah membesarkan, merawat dan mendidik penulis sejak kecil, serta memberikan doa, motivasi dan kasih sayang kepada penulis.

8. Adinda Deby Marsalina yang selalu memberikan dukungan, waktu dan doa dalam menyelesaikan tesis ini.

9. Bang Fauzan, Bang Reza, Muhammad Andry, Reza Destri Anggi, Reza Fikrih Utama, Bang Munazar, Hafid Syahputra, Kak ade, Kak Gita, Kak Ana dan seluruh teman-teman yang tidak penulis sebutkan satu persatu atas kerjasama dan kekompakannya selama penulis menjalani pendidikan.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangan dan perlu mendapatkan masukan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis berharap adanya kritik dan saran membangun demi kesempurnaan tesis ini.

ANALISIS SECARA SIMULTAN KANDUNGAN RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN PIRAZINAMID DALAM SEDIAAN TABLET SECARA

SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET DENGAN METODE RATIO ABSORBANCE DAN

AREA UNDER CURVE ABSTRAK

Standar terapi tuberkulosis secara umum menggunakan obat anti tuberculosis (OAT) seperti isoniazid, rifampisin, etambutol pirazinamid dan streptomisin.. Namun, kombinasi obat ini memberikan tantangan baru bagi industri farmasi sehubungan dengan pengembangan metode analisis baru dalam penentuan kadar. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode spektrofotometri secara ratio absorbance dan area under curve pada analisis rifampisin, isoniazid dan pirazinamid secara simultan dalam sediaan tablet tanpa adanya pemisahan.

Penelitian dilakukan dengan mengoptimasi jenis pelarut yaitu metanol, campuran metanol dapar fosfat pH 5; pH 6. Metode spektrofotometri ratio absorbance dan area under curve kemudian diuji validitasnya berdasarkan parameter validasi yaitu liniearitas, akurasi, presisi, LOD dan LOQ. Kemudian, metode ini diaplikasikan untuk menetapkan kadar rifampisin, INH dan pirazinamid dalam sediaan tablet, pengembangan metode spektrofotmetri dalam menentukan spektrum dan pemilihan gelombang pada komponen campuran, menggunakan faktor pembagi (divisor) untuk menetapkan secara simultan kadar campuran obat.

Hasil penelitian menunjukkan metanol dan metanol dapar fosfat pH 6 merupakan pelarut terbaik yang digunakan sebagai pelarut untuk analisis. Aplikasi secara ratio absorbance pada penetapan kadar rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dilakukan pada λ 259.8 nm dalam pelarut metanol dan pada λ 234.8 nm, λ 259.4 nm dan 262.2 nm dalam pelarut metanol dapar fosfat pH 6 secara berurutan. Pada aplikasi secara area under curve rifampisin, isoniazid dan pirazinamid ditetapkan kadarnya pada λ 248 – 258 nm, 260.2 – 270.2 nm dan 271.8 – 281.8 nm dalam pelarut metanol secara berurutan dan λ 248.8 – 258.8 nm, 261.2 – 271.2 nm dan 272.8 – 282.8 nm dalam pelarut metanol dapar fosfat pH 6 secara berurutan.

Berdasarkan hasil penelitian ini baik metode spektrofotometri ultraviolet secara ratio absorbance dan area under curve, keduanya berhasil menetapkan kandungan obat dalam sediaan tablet secara simultan, tanpa gangguan dari eksipien seperti yang ditunjukkan oleh hasil parameter validasi berada dalam kisaran yang dapat diterima.

Kata kunci: Rifampisin, isoniazid, pirazinamid, ratio absorbance, area under curve

ABSTRACT

The standard therapy of tuberculosis in general use anti tuberculosis (OAT) such as isoniazid, rifampicin, ethambutol and streptomycin. pyrazinamide.

However, the combination of these drugs provide a new challenge for the pharmaceutical industry with respect to the development of new methods of analysis in the determination of the levels. This research aims to develop a method of spectrophotometry in absorbance ratio and area under curve on analysis of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide simultaneously in preparations tablets without any separation.

Research is done by optimizing solvent type methanol, methanol buffer phosphate pH 5; pH 6. Absorbance ratio spectrophotometry method and area under curve then tested validation based on validation parameters, namely linearity, accuracy, precision, LOD and LOQ. Then, this method was applied to determine the levels of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide in the preparation of tablets.

The results showed that the methanol and methanol buffer phosphate pH 6 is the best solvent is used as a solvent for analysis. Ratio absorbance applications on the determination of the levels of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide performed at λ 259.8 nm in methanol solvent and in λ 259.4 nm, 234.8 nm and 262.2 nm in methanol buffer phosphate pH 6 as solvent respectively. On applications in the area under the curve rifampicin, isoniazid and pyrazinamide set simply applied on λ 248 – 258 nm, 260.2 – 270.2 nm and 271.8 – 281.8 nm in methanol solvent sequentially and λ 248.8 – 258.8 nm, 261.2 – 271.2 nm and 272.8 – 282.8 nm with methanol buffer phosphate pH 6 as solvent.

Based on the results of this research both ultraviolet spectrophotometry method in absorbance ratio and area under the curve, both of which managed to establish drug in tablet dosage form simultaneously, without the distractions of an excipient as shown by the results of parameter validation is in acceptable range.

Key word: Rifampicin, isoniazid, pyrazinamide, ratio absorbance, area under curve

SIMULTANEOUS ANALYSIS CONTENT OF RIFAMPICIN, ISONIAZID AND PYRAZINAMIDE IN TABLET DOSAGE FORM BY

SPECTROPHOTOMETRY ULTRAVIOLET WITH RATIO ABSORBANCE AND AREA UNDER CURVE METHOD

DAFTAR ISI

JUDUL ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PENGESAHAN TESIS ... iii

HALAMAN PERSETUJUAN TESIS ... iv

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ... v

KATA PENGANTAR ... vi

ABSTRAK ... viii

ABSTRACT ... ix

DAFTAR ISI ... x

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xvi

DAFTAR SINGKATAN ... x

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 5

1.3 Hipotesis ... 5

1.4 Tujuan Penelitian ... 6

1.5 Manfaat Penelitian ... 6

1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 8

2.1 Kombinasi Obat Anti Tuberkulosis (OAT) ... 8

2.1.1 Rifampisin ... 8

2.1.1.1 Sifat Fisikokimia ... 9

2.1.1.2 Penggunaan dan Cara Pemberian ... 9

2.1.1.3 Kegunaan ... 9

2.1.1.4 Efek Samping ... 10

2.1.2 Isoniazid ... 10

2.1.2.1 Sifat Fisikokimia ... 10

2.1.2.2 Penggunaan dan Cara Pemberian ... 11

2.1.2.3 Kegunaan ... 11

2.1.2.4 Efek Samping ... 11

2.1.3 Pirazinamid ... 12

2.1.3.1 Sifat Fisikokimia ... 12

2.1.3.2 Penggunaan dan Cara Pemberian ... 13

2.1.3.3 Kegunaan ... 13

2.1.3.4 Efek Samping ... 13

2.2 Analisis Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 13

2.3 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-Vis) ... 15

2.3.1 Metode Ratio Absorbance (RA) dan Aplikasinya dalam Bidang Farmasi ... 19

2.3.1.1 Double Divisor Ratio Spectra (DDRS) ... 23 2.3.2 Metode Area Under Curve (AUC) dan Aplikasinya dalam Bidang

Farmasi ... 24

2.4 Metode Penambahan Standar ... 27

2.5 Validasi Metode Analisis ... 28

2.6 Kerangka Teori Penelitian ... 31

BAB III METODE PENELITIAN ... 31

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 31

3.2 Alat dan Bahan ... 31

3.2.1 Alat – alat ... 31

3.2.2 Bahan – bahan ... 31

3.3 Prosedur Penelitian ... 32

3.3.1 Pembuatan Larutan Kalium Dihidrogenfosfat 0,1 M ... 32

3.3.2 Pembuatan Larutan Natrium Hidroksida 0,1 N ... 32

3.3.3 Pembuatan Larutan Dapar Fosfat pH 5 ... 32

3.3.4 Pembuatan Larutan Dapar Fosfat pH 6 ... 32

3.4 Optimasi Pelarut ... 32

3.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Rifampisin ... 32

3.4.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Isoniazid ... 33

3.4.3 Pembuatan Larutan Induk Baku Pirazinamid ... 33

3.4.4 Pembuatan Spektrum Serapan Rifampisin ... 33

3.4.5 Pembuatan Spektrum Serapan Isoniazid ... 33

3.4.6 Pembuatan Spektrum Serapan Pirazinamid ... 34

3.4.7 Pembuatan Spektrum Serapan Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 34

3.4.8 Pembuatan Spektrum Serapan dengan Metode Ratio Absorbance (RA) Terhadap Panjang Gelombang untuk Penentuan Panjang Gelombang Isoabsorpsi dan Panjang Gelombang Maksimum Terpilih ... 34

3.4.9 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Ratio Absorbance (RA) Rifampisin ... 35

3.4.10 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Ratio Absorbance (RA) Isoniazid... 35

3.4.11 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metode Ratio Absorbance (RA) Pirazinamid ... 35

3.4.12 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Rifampisin untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol .. 35

3.4.13 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Isoniazid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol 36

3.4.14 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Pirazinamid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol .. 36

3.4.15 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Rifampisin untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 36

3.4.16 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Isoniazid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 36

3.4.17 Penentuan Panjang Gelombang (λ) Analisis Pirazinamid untuk Metode Area Under Curve (AUC) Menggunakan Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6 ... 37

3.4.18 Pembuatan Kurva Kalibrasi Analisis Rifampisin untuk Metode Area Under Curve (AUC) ... 37

3.4.19 Pembuatan Kurva Kalibrasi Analisis Isoniazid untuk Metode Area Under Curve (AUC) ... 37

3.4.20 Pembuatan Kurva Kalibrasi Analisis Pirazinamid untuk Metode Area Under Curve (AUC) ... 37

3.5 Penetapan Kadar Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid Pada Sediaan Tablet P ... 38

3.5.1 Perhitungan Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet P ... 38

3.6 Validasi Metode ... 39

3.6.1 Linearitas, Batas Deteksi (Limit of Detection, LOD) dan Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification, LOQ) ... 39

3.6.2 Uji Perolehan Kembali ... 40

3.6.3 Pengujian Presisi ... 40

3.6.4 Analisis Data secara Statistik ... 41

3.7 Definisi Operasional Penelitian ... 42

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 42

4.1 Optimalisasi Jenis Pelarut ... 42

4.2 Spektrum Serapan ... 45

4.3 Metode Ratio Absorbance (RA)... 52

4.3.1 Spektrum Ratio Absorbance dengan Double Divisor ... 53

4.4 Metode Area Under Curve (AUC) ... 55

4.5 Validasi Metode ... 62

4.5.1 Liniearitas, Akurasi, Presisi, Batas Deteksi (Limit Of Detection, LOD) dan Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification, LOQ) ... 62

4.6 Penetapan Kadar Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid pada Sediaan Tablet ... 63

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 66

5.1 Kesimpulan ... 66

5.2 Saran ... 66

DAFTAR PUSTAKA ... 67

LAMPIRAN ... 73

DAFTAR TABEL

2.1 Aplikasi Spektrofotometri UV Terhadap Rifampisin, INH dan

Pirazinamid ... 14

2.2 Aplikasi Spektrofotometri UV secara Ratio Absorbance pada Berbagai Zat ... 22

2.3 Aplikasi Spektrofotometri UV secara Area Under Curve (AUC) pada Berbagai Zat ... 26

2.4 Kriteria Daerah Recovery yang apat Diterima ... 29

2.5 Kriteria Koefisien Variasi (KV) yang Dapat Diterima ... 29

3.1 Definisi Operasional Penelitian ... 42

4.1 Absorbansi dan % Transmitan Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 43

4.2 Kesalahan Fotometrik ... 43

4.3 Panjang Gelombang Analisis untuk Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Pelarut Metanol ... 56

4.4 Panjang Gelombang Analisis untuk Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 57

4.5 Nilai Linieritas, Akurasi, Presisi, LOD dan LOQ untuk Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Metode Ratio Absorbance dan Area Under Curve Menggunakan Pelarut Metanol ... 63

4.6 Nilai Linieritas, Akurasi, Presisi, LOD Dan LOQ untuk Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Metode Ratio Absorbance dan Area Under Curve Menggunakan Pelarut Metanol Dapar Posfat pH 6 ... 63

4.7 Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet P Menggunakan Pelarut Metanol dengan Metode Ratio Absorbance dan Area Under Curve ... 65

4.8 Kadar Rifampisin, INH dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet P Menggunakan Pelarut Metanol Dapar Posfat pH 6 Ratio Absorbance dan Area Under Curve ... 65

DAFTAR GAMBAR

1.1 Kerangka Pikir Penelitian ... 7

2.1 Struktur Rifampisin ... 8

2.2 Struktur Isoniazid ... 10

2.3 Struktur Pirazinamid ... 12

2.4 Error (Kesalahan) Pembacaan Terhadap %T (% transmitan) ... 16

2.5 Diagram Tingkat Energi Elektronik ... 17

2.6 Spektra yang Menunjukkan Area di Bawah Kurva untuk Komponen M .. 25

2.7 Spektra yang Menunjukkan Area di Bawah Kurva untuk Komponen N . 25 2.8 Kerangka Teori Penelitian ... 31

4.1 Grafik Jumlah Kesalahan Fotometrik Terhadap Jenis Pelarut ... 44

4.2 Spektrum Serapan Rifampisin dengan Pelarut Metanol Konsentrasi 6 – 18 µg/mL ... 45

4.3 Spektrum Serapan Tunggal Rifampisin dengan Pelarut Metanol Konsentrasi 12 µg/mL ... 46

4.4 Spektrum Serapan Isoniazid dengan Pelarut Metanol Konsentrasi 5 – 15 µg/mL ... 46

4.5 Spektrum Serapan Tunggal Isoniazid dengan Pelarut Metanol Konsentrasi 10 µg/mL ... 46

4.6 Spektrum Serapan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol Konsentrasi 6 – 12 µg/mL ... 47

4.7 Spektrum Serapan Tunggal Pirazinamid dengan Pelarut Metanol Konsentrasi 9 µg/mL ... 47

4.8 Spektrum Serapan Rifampisin dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Konsentrasi 6 – 18 µg/mL ... 47

4.9 Spektrum Serapan Tunggal Rifampisin dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Konsentrasi 12 µg/mL ... 48

4.10 Spektrum Serapan Isoniazid dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Konsentrasi 5 – 15 µg/mL ... 48

4.11 Spektrum Serapan Tunggal Isoniazid dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Konsentrasi 10 µg/mL ... 48

4.12 Spektrum Serapan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Konsentrasi 6 – 12 µg/mL ... 49

4.13 Spektrum Serapan Tunggal Pirazinamid Dengan Pelarut Metanol Dapar Posfat pH 6 Konsentrasi 9 µg/mK ... 49

4.14 Spektrum Tumpang Tindih Serapan Tunggal Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol ... 49

4.15 Spektrum Tumpang Tindih Serapan Tunggal Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 50

4.16 Spektrum Serapan Campuran Baku Rifampisin, Ison iazid dan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol... 50

4.17 Spektrum Serapan Campuran Baku Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 50

4.18 Spektrum Serapan Tumpang Tindih Campuran Baku dan Tunggal Rifampisin, Isonaizid dan Pirazinamid dalam Pelarut Metanol ... 51

4.19 Spektrum Serapan Tumpang Tind ih Campuran Baku dan Tunggal Rifampisin, Isonaizid dan Pirazinamid dalam Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 51 4.20 Tumpang Tindih Spektrum Rasio Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid Pelarut Metanol ... 53 4.21 Tumpang Tindih Spektrum Rasio Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 54 4.22 Ratio Absorbance untuk Analisis Tablet P dengan Pelarut Metanol ... 59 4.23 Ratio Absorbance untuk Analisis Tablet P dengan Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6 ... 59 4.24 Area Under Curve untuk Analisis Rifampisin 12 µg/mL Metanol . 59 4.25 Area Under Curve untuk Analisis INH 10 µg/mL Metanol ... 59 4.26 Area Under Curve untuk Analisis Pirazinamid 9 µg/mL Metanol . 59 4.27 Area Under Curve untuk Analisis Rifampisin 12 µg/m L

Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 60 4.28 Area Under Curve untuk Analisis Isoniazid 10 µg/mL Metanol

Dapar Fosfat pH 6 ... 60 4.29 Area Under Curve untuk Analisis Pirazinamid 9 µg/mL Metanol

Dapar Fosfat pH 6 ... 60 4.30 Area Under Curve untuk Analisis Spektrum Tumpang Tindih Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol . 61 4.31 Area Under Curve untuk Analisis Spektrum Tumpang Tindih Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6... 61 4.32 Area Under Curve untuk Analisis Tablet P dengan Pelarut

Metanol ... 62 4.33 Area Under Curve untuk Analisis Tablet P dengan Pelarut

Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 62

DAFTAR LAMPIRAN

1 Tablet P ... 74 2 Alat ... 74 3 Spektrum Serapan Optimasi Pelarut Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid dengan Pelarut Metanol, Metanol Dapar Fosfat pH 5 dan

Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 76 4 Contoh Perhitungan % Transmitan dan Kesalahan Fotometrik

Rifampisin, Isoniazid dan Prazinamid dalam Metanol ... 79 5 Spektrum Campuran Baku Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

dalam Pelarut Metanol dan Metanol Dapar Posfat pH 6 ... 81 6 Spektrum Tablet P Pelarut Metanol dan Metanol Dapar Fosfat pH 6 ... 82 7 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Rifampisin dalam Pelarut Metanol

Pada λ Maksimum dan λ Titik Isoabsorpsi dengan Menggunakan Metode Ratio Absorbance ... 83 8 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Isoniazid dalam Pelarut Metanol

pada λ Maksimum dan λ Titik Isoabsorpsi dengan Menggunakan Metode Ratio Absorbance ... 86 9 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Pirazinamid dalam Pelarut Metanol

Pada λ Maksimum dan λ Titik Isoabsorpsi dengan Mengunakan Metode Ratio Absorbance ... 89 10 Kurva Dan Perhitungan Kalibrasi Rifampisin dengan Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6 Pada λ Maksimum dan λ Titik Isoabsorpsi dengan Mengunakan Metode Ratio Absorbance ... 92 11 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Isoniazid dengan Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6 pada λ Maksimum dan λ Titik Isoabsorpsi dengan Mengunakan Metode Ratio Absorbance ... 95 12 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Pirazinamid dalam Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6 pada λ Maksimum dan λ Titik Isoabsorpsi Dengan Menggunakan Metode Ratio Absorbance ... 98 13 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Rifampisin dengan Pelarut Metanol

Mengunakan Metode Area Under Curve pada Panjang Gelombang

248 - 258 nm ... 101 14 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Isoniazid dengan Pelarut Metanol

Metode Area Under Curve pada Panjang Gelombang 260,2 – 270,2

nm ... 103 15 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Pirazinamid Dengan Pelarut

Metanol Metode Area Under Curve Pada Panjang Gelombang 271,8

– 281,8 nm ... 105 16 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Rifampisin dengan Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6 Mengunakan Metode Area Under Curve pada

Panjang Gelombang 248,8 – 258,8 nm ... 107 17 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Isoniazid dengan Pelarut Metanol

Dapar Fosfat pH 6 Metode Area Under Curve pada Panjang Gelombang 261,2 – 271,2 nm ... 109

18 Kurva dan Perhitungan Kalibrasi Pirazinamid dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Metode Area Under Curve pada Panjang

Gelombang 272,8 – 282,8 nm ... 111 19 Contoh Perhitungan Kadar Teoritis Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid pada Sediaan Tablet ... 113 20 Contoh Modifikasi Perhitungan Konsentrasi dengan Menggunakan

Metode Ratio Absorbance dari Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

Menggunakan Pelarut Metanol ... 116 21 Contoh Modifikasi Perhitungan Konsentrasi dengan Menggunakan

Metode Area Under Curve dari Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid dengan Pelarut Metanol ... 119 22 Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet P

dengan Pelarut Metanol Metode Ratio Absorbance ... 126 23 Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet P

dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Metode Ratio Absorbance ... 127 24 Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid Pelarut Metanol dalam

Sediaan Tablet P dengan Metode Area Under Curve ... 128 25 Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid Pelarut Metanol Dapar

Fosfat pH 6 dalam Sediaan Tablet P dengan Metode Area Under

Curve ... 129 26 Perhitungan Statistik Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

dengan Pelarut Metanol pada Tablet P Menggunakan Metode Ratio

Absorbance ... 130 27 Perhitungan Statistik Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 pada Tablet P

Menggunakan Metode Ratio Absorbance ... 134 28 Perhitungan Statistik Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

dengan Pelarut Metanol pada Tablet P Menggunakan Metode Area

Under Curve ... 138 29 Perhitungan Statistik Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 pada Tablet P

Menggunakan Metode Area Under Curve ... 142 30 Contoh Perhitungan Persentase Perolehan Kembali (% Recovery) ... 146 31 Contoh Perhitungan % Perolehan Kembali 100% ... 149 32 Contoh Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi

(LOQ) ... 152 33 Hasil Perhitungan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 153 34 Contoh Perhitungan Nilai Simpangan Baku Relatif (RSD) ... 155 35 Data Hasil Recovery Rifampsin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan

Pelarut Metanol Mengunakan Metode Ratio Absorbance ... 156 36 Data Hasil Recovery Rifampsin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan

Pelarut Metanol Dapar Posfat pH 6 Menggunakan Metode Ratio

Absorbance ... 158 37 Data Hasil Recovery Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan

Pelarut Metanol Menggunakan Metode Area Under Curve ... 160

38 Data Hasil Recovery Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dengan Pelarut Metanol Dapar Fosfat pH 6 Menggunakan Metode Area Under

Curve ... 162 39 Table Distribusi T ... 164 40 Sertifikat Analisis Bahan Baku Rifampisin, INH dan Pirazinamid ... 165

DAFTAR SINGKATAN OAT : Obat Anti Tuberkulosis

RFP : Rifampisin INH : Isoniazid PRZ : Pirazinamid UV : Ultraviolet

KCKT : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi RA : Ratio Absorbance

AUC : Area Under Curve

DDRS : Double Divisor Ratio Spectra

M : Metanol

MDF : Metanol Dapar Fosfat USP : United State Pharmacopeia

ICH : International Conference on Harmanization KV : Koefisien Variasi

LOD : Limit of Detection LOQ : Limit of Quantification SD : Standard Deviation

RSD : Relative Standard Deviation LIB : Larutan Induk Baku

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Standar terapi tuberkulosis secara umum menggunakan obat anti tuberkulosis (OAT) seperti isoniazid, rifampisin, etambutol, pirazinamid, dan streptomisin yang merupakan kelompok obat primer (Ditjen Binfar dan Alkes, 2005). Salah satu kombinasi OAT yang efektif dan sering digunakan dalam terapi tuberkulosis adalah kombinasi tiga obat yaitu rifampisin (RFP), isoniazid (INH), dan pirazinamid (PRZ) (Smith, 1999).

Kombinasi dari obat ini memberikan keuntungan terapi yang baik, karena meningkatkan kepatuhan terhadap pengobatan dan mengurangi resiko resistensi, biaya pengobatan dan kesalahan dalam pengobatan. Namun, kombinasi obat ini memberikan tantangan baru bagi industri farmasi sehubungan dengan pengembangan metode analisis baru dalam penentuan kadar (Tilinca et al., 2017).

Metode spektrofotomeri ultraviolet (UV) dapat digunakan untuk penetapan kadar rifampisin, isoniazid dan pirazinamid karena struktur rifampisin, isoniazid dan pirazinamid memiliki ikatan rangkap terkonjugasi, gugus kromofor dan gugus auksokrom yang merupakan persyaratan bahan yang dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV (Gandjar dan Rohman, 2012).

Terdapat berbagai macam metode penentuan kadar, salah satunya adalah spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan metode yang sederhana, efektif, cepat dan relatif lebih murah bila dibandingkan dengan metode lainnya. Namun demikian,

masih dibutuhkan pengembangan metode spektrofotometri agar lebih akurat dan fleksibel untuk analisis pengawasan mutu sediaan farmasi (Viplava et al., 2012).

Penetapan kadar dalam sediaan tablet rifampisin dapat dilakukan secara kromatografi, yaitu Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Penetapan kadar dapat juga dilakukan secara spektrofotometri infra merah dan spektrofotometri ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm (USP 30-NF 25, 2007; Depkes RI., 1995).

Penetapan kadar tablet isoniazid bentuk tunggal dapat ditentukan dengan metode KCKT (USP 30-NF 25, 2007; Depkes RI., 1995), titrasi Nitrimetri, titrasi Bromometri (Depkes RI., 1979). Penetapan kadar isoniazid dalam bentuk tunggal dapat ditetapkan dengan spektrofotometri UV dalam pelarut asam, isoniazid pada panjang gelombang 266 nm (Moffat et al., 2004).

Penelitian yang telah dilakukan Prasanthi et al., (2014) menetapkan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dengan mengggunakan KCKT.

Namun metode ini memerlukan waktu yang cukup lama untuk proses preparasi sampel karena adanya tahap ektraksi pelarut, pemanasan dan memerlukan biaya yang cukup mahal.

Penelitian yang dilakukan Asadpour et al., (2016), telah menetapkan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada sediaan tablet secara spektrofotometri ultraviolet dengan perhitungan multikomponen dan persamaan matriks. Metode ini tidak memerlukan waktu preparasi sampel yang lama, sederhana dan tidak mahal tetapi memerlukan proses perhitungan matematika yang rumit pada tahap analisisnya.

Penelitian yang dilakukan Mekuria (2008), telah menetapkan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada sediaan tablet secara

spektrofotometri derivatif dengan metode zero crossing. Metode ini tidak memerlukan proses preparasi sampel yang lama karena tidak dilakukan tahap pemisahan, tetapi memerlukan proses derivatisasi yang lama untuk mendapatkan nilai zero crossing.

Metode spektrofotometri secara Ratio Absorbance (RA) dan Area Under Curve (AUC) yang telah dilakukan oleh Chandra et al., (2017) untuk penetapan kadar propanolol hidroklorida, serta penelitian Asra et al., (2016) untuk penetapan kadar furosemid pada sediaan obat memberikan hasil yang akurat, presisi dan selektif.

Metode spektrofotometri secara RA dan AUC ini tidak memerlukan waktu preparasi sampel yang lama, pelarut yang banyak, perhitungan matematika yang rumit dan proses derivatisasi untuk penentuan nilai zero crossing (Chaudary et al., 2011).

Metode Ratio Absorbance (RA) melibatkan pengukuran absorbansi pada dua panjang gelombang, satu adalah λ max dari salah satu komponen (λ 2) dan yang lainnya adalah panjang gelombang absorptivitas yang sama dari dua komponen (λ 1) yang disebut titik isoabsorpsi (Asra, 2016).

Metode Area Under Curve (AUC) menggunakan daerah dua panjang gelombang. Area di bawah kurva dimana spektra kedua zat saling bertumpang tindih adalah daerah panjang gelombang yang dipilih untuk menentukan kadar kedua zat. Area di bawah kurva pada daerah panjang gelombang terpilih dihitung untuk kedua zat dan dilakukan analisis dengan menggunakan “Cramer’s Rule”

dan “Metode Matrix” (Chaudary et al., 2011).

Prosedur Double Divisor Ratio Spectra (DDRS) telah diaplikasikan terhadap spektrofotometri derivative untuk menyelesaikan campuran terner dan kuarterner. Campuran tiga senyawa X, Y dan Z yang memenuhi Hukum Lambert- Beer memiliki rentang panjang gelombang terpilih untuk digunakan, ketika absorbansi dari dua senyawa dalam campuran tiga senyawa sama, maka digunakan sebagai pembagi ganda (double divisor) (Rasha et al., 2007).

Pemilihan pelarut merupakan salah satu hal yang perlu diperhatikan pada analisis dengan menggunakan spektrofotometri UV agar diperoleh pelarut yang dapat melarutkan campuran senyawa pada sediaan obat serta diperoleh panjang gelombang yang maksimum dari campuran senyawa yang rentangnya berdekatan.

Beberapa penelitian yang telah dilakukan untuk penetapan kadar rifampisin, isoniazid dan pirazinamid menggunakan pelarut metanol, HCl 0,1 N dan acetonitril, sedangkan pada penelitian ini menggunakan pelarut metanol (M) dan campuran metanol dapar fosfat (MDF) pH 6 (Hanwar et al., 2017).

Berdasarkan uraian diatas, maka dalam penelitian ini akan dilakukan optimasi pelarut dan analisis secara simultan kandungan rifampisin (RFP), isoniazid (INH) dan pirazinamid (PRZ) tanpa adanya tahap pemisahan dalam sediaan tablet dengan metode Ratio Absorbance (RA) dan Area Under Curve (AUC) secara spektrofotometri ultraviolet.

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan uraian di atas, maka perumusan masalah dalam penelitian ini adalah:

a. Apakah metanol merupakan jenis pelarut terbaik jika dibandingkan dengan campuran metanol dapar fosfat pH 5; pH 6 untuk analisis secara simultan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid?

b. Apakah metode spektrofotometri ultraviolet secara RA dan AUC dapat digunakan untuk menetapkan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid secara simultan dan memenuhi syarat validasi metode?

c. Apakah metode spektrofotometri ultraviolet secara RA dan AUC dapat digunakan untuk menetapkan secara simultan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dalam sediaan tablet di pasaran?

1.3 Hipotesis

Berdasarkan perumusan masalah di atas, maka hipotesis dalam penelitian ini adalah:

a. Metanol merupakan jenis pelarut terbaik jika dibandingkan dengan campuran metanol dapar fosfat pH 5; pH 6 untuk analisis secara simultan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid.

b. Metode spektrofotometri ultraviolet secara RA dan AUC dapat digunakan untuk menetapkan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid secara simultan dan memenuhi syarat validasi metode.

c. Metode spektrofotometri ultraviolet secara RA dan AUC dapat digunakan untuk menetapkan secara simultan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dalam sediaan tablet di pasaran.

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

a. Untuk menentukan pelarut terbaik yang digunakan pada analisis secara simultan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid.

b. Untuk mengaplikasikan metode spektrofotometri ultraviolet secara RA dan AUC pada penetapan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid secara simultan dan memenuhi syarat validasi metode.

c. Untuk mengaplikasikan metode spektrofotometri ultraviolet secara RA dan AUC pada penetapan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid secara simultan dalam sediaan tablet di pasaran.

1.5 Manfaat Penelitian

Diharapkan metode hasil pengembangan dari penelitian ini dapat menjadi salah satu metode yang dapat diaplikasikan oleh instansi terkait dalam menentukan secara simultan kandungan rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dalam sediaan tablet.

1.6 Kerangka Pikir Penelitian

Penelitian ini meliputi optimasi pelarut yang digunakan, delta lambda dan rasio spektrum untuk mendapatkan panjang gelombang analisis rifampisin, isoniazid dan pirazinamid kemudian metode dan kondisi diaplikasikan terhadap tablet yang mengandung campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid, selanjutnya metode divalidasi. Secara ringkas kerangka pikir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.1

I

II

II

III

Gambar 1.1 Kerangka Pikir Penelitian (I) Optimasi Pelarut (II) Metode Ratio Absorbance (RA) (III) Metode Area Under Curve (AUC)

Variabel Bebas Jenis Pelarut:

- Metanol pH 6,8 - Campuran MDF

pH 5; pH 6

Variabel Terikat Obat:

Rifampisin Isoniazid Pirazinamid

- Absorbansi (Parameternya adalah

Kesalahan Fotometrik) - Kelarutan

Variabel Bebas Metode:

Ratio Absorbance (RA)

- Titik Isoabsorpsi - λ analisis

Variabel Terikat Obat:

Rifampisin Isoniazid Pirazinamid

Variabel Bebas Metode:

Area Under Curve (AUC) - ∆λ (5; 10;

15) - λ analisis

Variabel Terikat Obat:

Rifampisin Isoniazid Pirazinamid

Kadar:

90 - 110%

Validasi Metode

Validasi Metode Kadar:

90 - 110%

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kombinasi Obat Anti Tubekulosis (OAT)

Dalam pengobatan tuberkulosis, Obat Anti Tuberkulosis (OAT) lini pertama merupakan jenis obat utama yang digunakan, di antaranya adalah isoniazid, rifampisin, pirazinamid, streptomisin, dan etambutol. Kemasan obat- obat tersebut merupakan obat tunggal, disajikan secara terpisah, masing- masing isoniazid, rifampisin, pirazinamid dan etambutol atau bisa juga sebagai obat kombinasi dosis tetap (KDT), terdiri dari 3 atau 4 obat dalam satu tablet (Tan dan Rahardja, 2007).

2.1.1 Rifampisin

Rifampisin adalah kelompok antimikobakterial dan digunakan untuk pengobatan berbagai jenis infeksi. Sering digunakan dalam bentuk kombinasi dengan antibakterial lainnya untuk menghindari resistensi dan untuk pengobatan tuberkulosis (Sweetman, 2009).

2.1.1.1 Sifat Fisikokimia

Rumus Struktur Rifampisin dapat dilihat pada Gambar 2.1

Gambar 2.1 Rumus Struktur Rifampisin

Rumus Molekul: C43H58N4O12

Berat Molekul: 822,95

Nama Kimia : 5, 6, 9, 17, 19, 21-Heksahidroksi-23-metoksi-2, 4, 12, 16, 18, 20, 22 heptametil-8 [N-(4-metil-1-piperazinil) formimidoil]-2, 7- (epoksipentadeka [1, 11, 13] trienimino) nafto [2, 1-b] furan- 1, 11- (2H)-dion-21-asetat.

Sinonim : Rifampicinum, Rifampin, Rivalzadin, 3-[{(4-Metil-1-piperazinil) imino} metil] rifamisin.

Kandungan : Tidak kurang dari 95,0 % dan tidak lebih dari 103,0 % C43H58N4O12

per mg, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.

Pemerian : Serbuk hablur, coklat kemerahan

Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air, mudah larut dalam klorofom, larut dalam etil asetat dan dalam metanol

(Depkes RI, 1995).

2.1.1.2 Penggunaan dan Cara Pemberian

Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah 600 mg per hari secara oral pada keadaan lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak diberikan dosis 10 mg/kg hingga 20 mg/kg per hari dengan batas maksimum 600 mg per hari (Sweetman, 2009).

2.1.1.3 Kegunaan

Rifampisin bersifat bakterisid luas terhadap pertumbuhan bakteri tuberkulosis, baik yang di luar maupun di dalam sel, juga mematikan kuman yang dormant selama fase – fase pembelahan yang singkat (Tan dan Rahardja, 2007).

2.1.1.4 Efek Samping

Penyakit kuning, mual, muntah, sakit ulu hati, kejang perut, diare, gejala gangguan sistem saraf pusat dan reaksi hipersensitivitas (Tan dan Rahardja, 2007).

2.1.2 Isoniazid

Isoniazid adalah turunan hidrazida dan merupakan obat utama dalam pengobatan penyakit tuberkulosis, sering digunakan dalam bentuk kombinasi.

Obat yang juga dikenal dengan isonicotinylhydrazide ini biasanya dikombinasikan dengan obat tuberkulosis lain seperti etambutol, pirazinamid dan rifampisin (Sweetman, 2009).

2.1.2.1 Sifat Fisikokimia

Rumus Struktur Isoniazid dapat dilihat pada Gambar 2.2

Gambar 2.2 Rumus Struktur Isoniazid Rumus Molekul : C6H7N3O

Berat Molekul : 137,14

Nama Kimia : Asam Isonikotinat Hidrazida

Sinonim : Isoniazidum, Isonikotinoilhidrazin, Isonikotinilhidrazida, Isonikotinilhidrazin, Tubazid.

Kandungan : Tidak kurang dari 98% dan tidak lebih dari 102,0% C6H7N3O, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.

Pemerian : Hablur putih atau tidak berwarna atau serbuk hablur putih, tidak berbau, perlahan – lahan dipengaruhi oleh udara dan cahaya.

Kelarutan : Mudah larut dalam air, agak sukar larut dalam etanol, sukar larut dalam kloroform dan dalam eter, larut dalam 8 bagian air dan 50 bagian alkohol

(Depkes RI, 1995).

2.1.2.2 Penggunaan dan Cara Pemberian

Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah 300 mg per hari secara oral pada keadaan lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak bervariasi, yaitu: 5 mg/kg per hari (Organisasi Kesehatan Dunia (World Health Organization/WHO)), 10 mg/kg per hari (Inggris (United Kingdom/UK)) dan 10 mg/kg hingga 15 mg/kg per hari (Amerika Serikat (United States of America/USA)) dengan semuanya mencantumkan batas maksimum 300 mg per hari (Sweetman, 2009).

2.1.2.3 Kegunaan

Isoniazid berkhasiat tuberkulostatis paling kuat dan bersifat bakterisid terhadap basil yang sedang tumbuh pesat (Tan dan Rahardja, 2007).

2.1.2.4 Efek Samping

Mual, muntah, anoreksia, letih, malaise, lemah, gangguan saluran pencernaan lain, neuritis perifer (paling sering terjadi dengan dosis 5mg/kgBB/hari), neuritis optikus, hipersensitivitas, demam, ruam, ikterus, kejang, sakit kepala, mengantuk, pusing, mulut kering, kekurangan vitamin B6,

hiperglikemia, asidosis metabolik, ginekomastia, gejala reumatik, gejala mirip systemic lupus erythematosus (Tan dan Rahardja, 2007).

2.1.3 Pirazinamid

Pirazinamid merupakan suatu bakterisida, terutama untuk basil tuberkel intraseluler dimana obat ini efektif untuk tuberkulosis yang merupakan infeksi intraseluler. Obat ini aktif terhadap bakteri tuberkulosis yang telah resisten terhadap streptomisin dan isoniazid (Sweetman, 2009).

2.1.3.1 Sifat Fisikokimia

Rumus Struktur Pirazinamid dapat dilihat pada Gambar 2.3

Gambar 2.3 Rumus Struktur Pirazinamid Rumus Molekul : C5H5N3O

Berat Molekul : 123,11

Nama Kimia : Piridoksol hidroklorida

Sinonim : Pirazinamidum, Asam pirazinoat amida.

Kandungan : Tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0% C5H5N3O, dihitung terhadap zat anhidrat.

Pemerian : Serbuk hablur, putih hingga praktis putih, tidak berbau atau praktis tidak berbau.

Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, sukar larut dalam etanol, dalam eter dan dalam kloroform, larut dalam 67 bagian air, dalam 175 bagian alkohol, sedikit larut dalam klorofom

(Depkes RI, 1995).

2.1.3.2 Penggunaan dan Cara Pemberian

Pirazinamid adalah salah satu jenis obat dari terapi tuberkulosis, awal terapi adalah selama 8 minggu. Pirazinamid biasanya diberikan per hari atau 2 kali sampai 3 kali seminggu. Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah maksimum 3 g per hari secara oral. Sedangkan pada pasien anak-anak dosis yang diberikan 35 mg/kg per hari di Amerika Serikat (United States of America (USA)) dengan batas maksimum 1,5 g per hari (Sweetman, 2009).

2.1.3.3 Kegunaan

Pirazinamid bekerja sebagai bakterisida atau bakteriostatik, tergantung pada pH dan kadarnya di dalam darah dengan spektrum kerja yang sempit (Tan dan Rahardja, 2007).

2.1.3.4 Efek Samping

Efek samping dari penggunaan pirazinamid adalah gangguan hati, anemia dan efek samping lainnya (mual, muntah, demam, hiperurisemia, asam urat dan disuria) (Sweetman, 2009).

2.2 Analisis Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

Penetapan kadar dalam sediaan tablet rifampisin dapat ditentukan dengan kromatografi, yaitu kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi dan spektrofotometri (USP 30-NF 25, 2007; Depkes RI, 1995). Sedangkan, penetapan kadar tablet isoniazid bentuk tunggal dapat ditentukan dengan metode

kromatografi cair kinerja tinggi (USP 30-NF 25, 2007; Depkes RI, 1995), titrasi nitrimetri dan titrasi bromometri (Depkes RI, 1979). Penetapan kadar dalam sediaan tablet pirazinamid dapat dilakukan secara volumetri dengan titrasi semi bebas air sebagai asam dan basa. Penetapan kadar dalam sediaan tablet pirazinamid dapat dilakukan secara kromatografi, yaitu kromatografi lapis tipis, kromatografi gas maupun kromatografi cair kinerja tinggi (USP 30-NF 25, 2007;

Depkes RI., 1995).

Penelitian yang dilakukan Asadpour et al., (2016), telah menetapkan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada sediaan tablet secara spektrofotometri ultraviolet dengan perhitungan multikomponen dan persamaan matriks. Metode ini tidak memerlukan waktu preparasi sampel yang lama, sederhana dan tidak mahal tetapi memerlukan proses perhitungan matematika yang rumit pada tahap analisisnya.

Beberapa penelitian lain yang telah dilakukan untuk analisis rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dapat dilihat pada tabel 2.1 berikut:

Tabel 2.1 Penelitian yang Telah Dilakukan untuk Analisis Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

Senyawa Metode λ max

(nm) Pelarut Referensi Rifampisin,

Isoniazid dan Pirazinamid

High Performance Liquid Chromatography

260 nm

Acetonitril dan Tetrabutyl

ammoniu m hydro chloride

Glass et al., (2007)

Rifampisin, Isoniazid

dan Pirazinamid

Spectrophotometric UV Multivariate

475 nm, 338 nm dan 268

nm

Metanol Fonseca et al., (2015) Rifampisin,

Isoniazid

Spectrophotometric Second Derivative

302,40

nm, HCl 0,1 N Muchlisyam et al., (2016)

dan Pirazinamid

299,80 nm dan 253,60 nm Rifampisin,

Isoniazid dan Pirazinamid

Spechtrophotometri c

UV Chemometric

335 nm, 279 nm dan 269

nm

HCl 0,1 N ^Mekuria, ₍₂₀₀₈₎

2.3 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-Vis)

Dasar analisis kuantitatif senyawa obat dengan spektrofotometri UV-Vis adalah Hukum Lambert-Beer (Gandjar dan Rohman, 2012). Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel yang disinari, sedangkan menurut Beer, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi. Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dengan persamaan:

A = A (1%,1cm).b.c (g/100 mL)

A adalah serapan pada panjang gelombang; A (1% 1cm) adalah serapan jenis pada panjang gelombang; b adalah ketebalan lapisan yang menyerap dalam cm; c adalah kadar zat terlarut yang menyerap, dinyatakan dalam persen b/v (Depkes RI, 1995). Umumnya zat yang akan dianalisis dibuat absorbansinya mendekati 0,4343, atau dibuat absorbansi berada pada daerah 0,2-0,8. Hal ini dikarenakan jika analit diukur pada daerah tersebut nilai kesalahan fotometriknya kecil atau lebih kecil jika absorbansi analit diukur diluar daerah 0,2-0,8. Plot error (kesalahan) pembacaan terhadap % Transmitan dapat dilihat pada Gambar. 2.4.

Gambar 2.4 Plot Error (Kesalahan) Pembacaan Terhadap % T (% transmitan)

Rumus kesalahan fotometrik:

dc

c = 0,4343 T ( log T)dt Keterangan :

dc

c = kesalahan fotometrik

dt = kesalahan pembacaan (1%)

Absorbansi = 2- log %T

% T = antilog (2-A)

Jika A = 0,4343, maka memberikan %T = 36,3078 Kesalah fotometrik = 2,7185

Teknik spektrofotometri adalah suatu teknik analisis fisika kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik.

Pada prinsipnya interaksi radiasi elektromagnetik dengan molekul akan menghasilkan satu atau dua dari tiga kejadian yang mungkin terjadi. Ketiga macam kejadian yang mungkin terjadi adalah hamburan (scattering), absorpsi (absorption) dan emisi (emission) radiasi elektromagnetik oleh atom atau molekul yang diamati (Mulja dan Suharman, 1995).

Apabila pada suatu molekul dikenakan radiasi elektromagnetik maka akan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital

elektron “anti-bonding” (Mulja dan Suharman, 1995). Diagram tingkat elektron pada keadaan dasar dan keadaan tereksitasi ditunjukkan pada Gambar 2.5

Gambar 2.5 Diagram Tingkat Energi Elektronik

Absorpsi sinar ultraviolet oleh suatu atom atau molekul M dapat dianggap melalui dua proses. Proses pertama adalah eksitasi yang ditunjukkan oleh persamaan: M + hv M^*

Suatu radiasi foton ketika melewati molekul, adsorpsi dapat terjadi jika energi foton tersebut sesuai dengan perbedaan energi di antara dan satu tingkat energi yang lebih tinggi dari molekul tersebut. Pada keadaan ini energi dari foton ditransfer kepada molekul tersebut dan mengubahnya ke tingkat energi yang lebih tinggi yang disebut excited state M^*, proses terakhir adalah relaksasi. Setelah suatu periode singkat, molekul berelaksasi ke tempat aslinya atau ground state dengan mentransfer kelebihan energinya ke atom atau molekul lain pada medium tersebut. Proses ini menyebabkan peningkatan temperatur lingkungan sementara, seperti yang ditunjukkan pada persamaan berikut:

M* M + energi

Absorpsi sinar UV dalam suatu molekul disebabkan karena adanya elektron yang bertanggung jawab terhadap absorpsi sinar tersebut. Dua tipe elektron yang bertanggung jawab terhadap absorpsi radiasi UV dalam molekul

yaitu elektron terbagi yang berpartisipasi langsung dalam pembentukan ikatan dan yang tergabung dengan lebih dari satu atom dan elektron luar tidak terbagi yang banyak terlokalisasi pada atom seperti oksigen, halogen, sulfur dan nitrogen (Skoog, 1994).

Aplikasi spektroskopi serapan untuk senyawa organik didasarkan pada transisi n atau π ke π^* karena energi yang dibutuhkan untuk proses ini membawa puncak absorpsi ke daerah spektra 200 – 700 nm. Kedua transisi ini membutuhkan gugus tidak jenuh yang memberikan orbital π (Skoog, 1994).

Transisi π ke π^* ini menunjukkan pergeseran merah (geseran batokromik) dengan adanya substitusi gugus-gugus yang memberi atau menarik elektron (Sastrohamidjojo, 1991).

Senyawa organik pada umumnya mempunyai gugusan atom yang dapat mengabsorpsi radiasi UV disebut sebagai kromofor (Mulja dan Suharman, 1995).

Pusat serapan sinar ultraviolet ada pada kromofor (Skoog, 1985). Kromofor merupakan suatu gugus kovalen tidak jenuh yang bertanggung jawab untuk serapan elektronik. Sebagai contoh C-C, C-O dan NO2 (Silverstein et al., 1974).

Senyawa organik dikenal memiliki gugus auksokrom, yakni gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas seperti –OH, O-NH2 dan OCH3 yang memberikan transisi (n σ^*) (Mulja dan Suharman, 1995). Apabila auksokrom terikat pada suatu kromofor maka akan merubah baik panjang gelombang dan intensitas dari serapan (Silverstein et al., 1974). Auksokrom akan menggeser puncak serapan ke arah panjang gelombang yang lebih panjang (geseran merah/red shift/geseran batokromik) dengan disertai peningkatan intensitas (Skoog, 1985).

Geseran batokromik adalah geseran dari serapan ke panjang gelombang yang lebih panjang karena sisipan atau pengaruh pelarut (geseran merah/red shift).

Geseran hipokromik adalah geseran dari serapan ke panjang gelombang yang lebih pendek karena gugus ganti atau pengaruh pelarut (geseran biru/blue shift).

Efek hiperkromik adalah suatu kenaikan di dalam intensitas serapan akibat adanya gugus ganti atau pengaruh pelarut. Sedangkan efek hipokromik adalah suatu penurunan di dalam intensitas serapan karena pengaruh pelarut.

2.3.1 Metode Ratio Absorbance (RA) dan Aplikasinya Dalam Bidang Farmasi

Metode ini juga disebut “metode perbandingan penyerapan” adalah modifikasi dari metode persamaan simultan. Menurut metode ini, perbandingan penyerapan pada dua panjang gelombang untuk suatu zat, yang harus mematuhi hukum Lambert – Beer, merupakan nilai konstanta yang independen dari konsentrasi dan panjang lintasan dua panjang gelombang. Konstanta ini disebut sebagai “Hufner’s Quetient”.

Metode ini melibatkan pengukuran absorbansi pada dua panjang gelombang, satu adalah λ max dari salah satu komponen (λ 2) dan yang lainnya adalah panjang gelombang absorptivitas yang sama dari dua komponen (λ 1) yang disebut titik isoabsorpsi.

Konsentrasi masing – masing komponen dapat dihitung dengan persamaan matematis berikut:

Ca = ^Qm-Qy

Qx-Qy x ^A

a1 (1)

Cb = ^Qm-Qx

Qy-Qx x ^A

a2 (2)

Keterangan:

A = Absorbansi pada panjang gelombang isoabsorpsi

a1 dan a2 = Absorptivitas x dan y pada panjang gelombang isoabsorpsi Ca = Konsentrasi komponen x

Cb = Konsentrasi komponen y

Qm = ^A2 A1 Keterangan:

A2 = Absorbansi dari larutan sampel pada panjang gelombang maksimum dari suatu komponen (λ 2)

A1 = Absorbansi dari larutan sampel pada panjang gelombang maksimum isoabsorpsi dua komponen (λ 1)

Qx =

^ax2

ax1

Keterangan:

ax2 = Absorbansi dari sampel x pada panjang gelombang maksimum dari satu komponen (λ 2)

ax1 = Absorbansi dari sampel x pada panjang gelombang maksimum isoabsorpsi dua komponen (λ 1)

Qy = ^ay2

ay1

Keterangan:

ay2 = Absorbansi dari sampel y pada panjang gelombang maksimum dari satu komponen (λ 2)

ay1 = Absorbansi dari sampel y pada panjang gelombang maksimum isoabsorpsi dua komponen (λ 1).

Erram dan Tipnis di dalam Kamal et al., (2016) menyatakan tentang pengembangan metode titik isosbestik. Teknik ini hanya bisa digunakan bila spektra dari dua komponen yang mempunyai konsentrasi yang sama dan diteliti silang pada titik yang disebut isoabsorptivity point. Pada titik isosbestic kedua obat tersebut memiliki absorptivitas yang sama dan campurannya berperan sebagai satu komponen dan memberikan absorbansi yang sama dengan komponen obat murni.

Teori ini dapat dikonfirmasikan secara eksperimental dengan menghitung hasil pengukuran spektrum absorbansi pada konsentrasi tertentu dari dua obat dengan membandingkan dari spektrum absorbansi dari campuran biner yang mengandung konsentrasi yang sama. Nilai absorbansi pada titik isosbestik (Aiso) ditentukan.

Beberapa penelitian yang telah dilakukan Gaurang et al., (2013) telah mengembangkan metode spektrofotometri secara RA untuk penetapan kadar secara simultan loteprednol etabonat dan moxifloxacin HCl, memberikan hasil yang baik dan akurat tanpa langkah pemisahan maupun derivatisasi terlebih dahulu.

Penelitian yang dilakukan oleh Sravanthi et al., (2017) telah menentukan kadar dua obat yaitu metoprolol suksinat dan hidroklortiazid dengan

menggunakan tiga metode spektrofotometri sekaligus yaitu berdasarkan simultaneous equation method, area under curve method dan q-absorbance ratio method. Hasil menunjukkan bahwa ketiga metode tersebut dapat digunakan untuk analisis metoprolol suksinat dan hidroklortiazid secara simultan dan tidak ada perbedaan yang signifikan terhadap ketiga metode tersebut.

Salam et al., (2015) melakukan penetapan kadar mebendazol dengan mengembangkan lima metode spektrofotometri sekaligus yaitu dengan first derivative method, dual wave length method, area under curve method, q-absorbance ratio method dan absorbance substraction method. Hasil yang diperoleh dari gabungan kelima metode tersebut tidak memberikan perbedaan hasil yang signifikan dan akurat. Aplikasi beberapa metode RA dapat dilihat pada Tabel 2.2.

Tabel 2.2 Aplikasi Spektrofotometri UV dengan Metode Ratio Absorbance pada Berbagai Zat

Senyawa/sediaan Metode/Teknik Pelarut Referensi Rifampisin dan

Piperin

Spectrophotometry UV Q- Absorbance

ratio method

Metanol Kamar and Patel, (2012) Eperison dan

Parasetamol

Spectrophotometry UV Q- Absorbance

ratio method

Metanol Khanage et al., (2013) Valacyclovir

hidroklorida monohidrat dan

Ritonavir

Spectrophotometry UV Q- Absorbance

ratio method

HCl 0,1 M Dinakaran et al., (2013)

Cefiksim dan Ofloksasin

Spectrophotometry UV Q- Absorbance

ratio method

Metanol Dube et al., (2011) Ketoprofen, Metil

paraben dan Propil paraben

Spectrophotometry UV Q- Absorption ratio and Area under

curve method

Metanol Pallavi et al., (2013)

Atorvastatin dan Niacin

Spectrophotometry UV simultanepus

equation and Q- Absorbance ratio

method

Metanol Ramesh et al., (2012)

Saxagliptin dan Metildopa

Spectrophotometry UV simultanepus

equation, Q Absorbance ratio and

Area under curve method

Distilled water

Sawant and Mhaske, (2014)

Naproksen dan Esomeprazole

Spectrophotometry simultaneous equation, absorption

correction, Q Absorbance ratio and area under curve

methods

Metanol Jain et al., (2011)

2.3.1.1 Double Divisor Ratio Spectra (DDRS)

Metode DDRS telah diaplikasikan terhadap spektrofotometri derivative untuk menyelesaikan campuran terner dan kuarterner. Campuran tiga senyawa X, Y dan Z yang memenuhi Hukum Lambert-Beer memiliki rentang panjang gelombang terpilih untuk digunakan, dapat ditulis pada persamaan:

Am, λi = αx, λi CX + βy, λi CY + πz, λi CZ (1) Am,λi merupakan absorbansi pada panjang gelombang maksimum campuran ketiga senyawa, αx, λi, βy, λi dan πz, λi merupakan absorptifitas dari senyawa X, Y dan Z, sedangkan CX, CY dan CZ merupakan konsentrasi dari senyawa X, Y dan Z.

Absorbansi dari dua senyawa dalam campuran tiga senyawa yang sama, maka digunakan sebagai pembagi ganda (double divisor), dituliskan pada persamaan berikut:

Amo

,λi = αx, λi C^oX + βy, λi C^oY (2) Kemudian persamaan (1) dibagi dengan persamaan (2), dapat dituliskan sebagai berikut:

Am,λi

αx, λi C^oX + βy, λi C^oY

=

_α^{αx, λi CX + βy, λi CY}

x, λi C^oX + βy, λi C^oY

+

_α ^{πZ, λi CZ}

x, λi C^oX + βy, λi C^oY (3)

Menentukan konsentrasi senyawa Z diperlukan pembagi ganda (double divisor) yaitu senyawa X dan Y yang memiliki absorbansi yang sama (titik isosbestik) yang dituliskan pada persamaan (3) (Rasha et al., 2007)

2.3.2 Metode Area Under Curve (AUC) dan Aplikasinya dalam Sediaan Farmasi

Metode ini dapat digunakan untuk menentukan kadar senyawa tunggal maupun campuran dua zat tanpa adanya pemisahan terlebih dahulu dan derivatisasi spektrum.

Metode ini menggunakan daerah dua panjang gelombang. Area di bawah kurva dimana spektra kedua zat saling bertumpang tindih adalah daerah panjang gelombang yang dipilih untuk menentukan kadar kedua zat. Area di bawah kurva pada daerah panjang gelombang terpilih dihitung untuk kedua zat dan dilakukan analisis dengan menggunakan “Cramer’s Rule” dan “Metode Matrix” (Chaudary et al., 2011).

Pada campuran yang mengandung dua komponen M dan N. Dari kedua spektra (Gambar 2.6 dan Gambar 2.7), diperoleh informasi di bawah ini:

AUC^Mλ1 – λ2 : area di bawah kurva untuk komponen M pada daerah panjang gelombang λ1 – λ2

AUC^Mλ3 – λ4 : area di bawah kurva untuk komponen M pada daerah panjang gelombang λ3 – λ4

AUC^Nλ1 – λ2 : area di bawah kurva untuk komponen N pada daerah panjang gelombang λ1 – λ2

AUC^Nλ3 – λ4 : area di bawah kurva untuk komponen N pada daerah panjang gelombang λ3 – λ4

Gambar 2.6 Spektra yang menunjukkan area di bawah kurva untuk komponen M

Gambar 2.7 Spektra yang menunjukkan area di bawah kurva untuk komponen N Total area di bawah kurva campuran pada daerah panjang gelombang tertentu adalah sama dengan jumlah area di bawah kurva dari masing-masing komponen pada daerah panjang gelombang yang sama. Area di bawah kurva dari campuran yang mengandung komponen M dan N dapat ditentukan dengan cara sebagai berikut:

AUC λ1 – λ2 = AUC^Mλ1 – λ2 + AUC^Nλ1 – λ2……… (1) AUC λ3 – λ4 = AUC^Mλ3 – λ4 + AUC^Nλ3 – λ4……… (2) Persamaan di atas juga dapat ditulis sebagai berikut:

AUC λ1 – λ2 = X^M λ1 – λ2 bC^Mλ1 – λ2 + X^N λ1 – λ2 bC^N λ1 – λ2……… (3) AUC λ3 – λ4 = X^Mλ3 – λ4 bC^Mλ3 – λ4 + X^Nλ3 – λ4 bC^Nλ3 – λ4 ……… (4) X λ1 – λ2 = AUC λ1 – λ2 / Konsentrasi dalam g/l,

X λ3 – λ4 = AUC λ3 – λ4 / Konsentrasi dalam g/l

Menggunakan “Cramer’s Rule” dan “Metode Matriks” konsentrasi komponen M dan Komponen N dapat ditentukan dengan persamaan berikut:

C^M = XNλ1 – λ2 AUC λ3 – λ4 - XNλ3 – λ4 AUC λ1 – λ2/ XNλ1 – λ2 XMλ3 – λ4 - XNλ3 – λ4 XMλ1 – λ2

C^N = XMλ1 – λ2 AUC λ3 – λ4 – XMλ3 – λ4 AUC λ1 – λ2/ XNλ1 – λ2 XMλ3 – λ4 - XNλ3 – λ4 XMλ1 – λ2

Metode spektrofotometri secara Area Under Curve (AUC) yang telah dilakukan oleh Karajgi et al., (2016) untuk penetapan kadar cefprodoksim proksetil, serta penelitian Rana et al., (2012) untuk penetapan kadar secara simultan lafutidin dan domperidon pada sediaan obat memberikan hasil yang akurat, presisi dan selektif. Metode spektrofotometri secara Area Under Curve (AUC) ini tidak memerlukan waktu preparasi sampel yang lama, banyak pelarut perhitungan matematika yang rumit dan derivatisasi untuk penentuan nilai zero crossing (Chaudary et al., 2011). Aplikasi Spektrofotometri dengan metode AUC dapat dilihat pada Tabel 2.3

Tabel 2.3 Aplikasi Spektrofotometri dengan metode Area Under Curve Senyawa/sediaan Metode Pelarut Referensi

Piperacillin dan Tazobactam

Area under curve

method Metanol Sangeetha et al., (2017)

Ibuprofen dan Famotidin

Area under curve

method Metanol Dineshbhai et al., (2016)

Domperidon dan Pantoprazol

Area under curve

method Metanol Chopade and

Khalate, (2016)

Ornidazol Area under curve

methods HCl 0,1 N Rele, (2015)

Olmesartan medoxomil dan Hidroklorotiazid

Area Under Curve and Dual Wavelength Spectrophotometric

Methods

Metanol Ilango and Kumar, (2012)

Zolmitriptan

Spectrophotometry UV first derivative and

area under curve method

HCl 0,1 N Acharjya et al., (2011)

2.4 Metode Penambahan Standar

Metode penambahan standar adalah suatu metode dimana pada jumlah sampel yang sama ditambahkan larutan standar dengan konsentrasi yang berbeda, ada tiga teknik yang dapat digunakan dalam analisis secara spektrofotometri:

a. Metode Standar Tunggal

Metode ini menggunakan satu larutan standar yang telah diketahui kaonsentrasinya. Selanjutnya absorpsi larutan standar dan absorbansi larutan sampel diukur dengan spektrofotometri.

b. Metode Kurva Kalibrasi

Metode ini membuat suatu seri larutan standar dengan berbagai kosentrasi dan absorbansi kemudian dibuat kedalam grafik yang merupakan suatu garis lurus melewati titik nol. Konsentrasi larutan sampel dapat dicari setelah absorbansi larutan sampel diukur dan diintrapolasi kedalam kurva kalibrasi atau di masukkan kedalam persamaan garis lurus yang diperoleh dengan persamaan regresi linear.

c. Metode Adisi Standar

Metode ini digunakan secara luas karena mampu meminimalkan kesalahan yang disebabkan oleh perbedaan kondisi lingkungan (matriks)