BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Optimasi Jenis Fase Diam, Fase Gerak, Suhu Oven, dan Laju Alir
2. Optimasi pH dan polaritas fase gerak dalam analisis PPD dengan
asetonitril dan air atau air yang diberi dapar fosfat, serta asetonitril dan air yang diberi amonia 10% atau asam asetat 0,05 M atau asam formiat. Optimasi fase gerak dilakukan dengan menambah, mengurangi, atau mengubah komponen fase gerak. Sistem elusi yang digunakan dalam penelitian ini adalah sistem isokratik yaitu, komposisi fase gerak sama selama pengukuran berlangsung.
Metanol dan asetonitril digunakan sebagai kombinasi dengan air karena pada pemisahan dengan fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kekuatan elusi meningkat seiring dengan meningkatnya polaritas fase gerak dan sebaliknya, pada pemisahan dengan fase terbalik (fase diam lebih nonpolar
daripada fase gerak), kekuatan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas fase gerak (Kealey and Haines, 2002) (Gambar 15). Polaritas (P’) air yang tinggi (Tabel V) membuatnya menjadi eluen paling kuat pada KCKT fase normal karena air berinteraksi dengan gugus polar fase diam, sehingga analit sulit berinteraksi dengan fase diam dan akan terelusi lebih cepat, sebaliknya, air merupakan eluen yang lemah pada KCKT fase terbalik karena sulit membasahi fase diam yang nonpolar. Hal ini juga membuat fase gerak yang mengandung semakin banyak air akan mempunyai waktu retensi yang semakin lama pada KCKT fase terbalik. Kekuatan elusi pelarut pada fase diam polar dapat dilihat pula dari nilai εº (Tabel
V). Semakin tinggi εº, semakin kuat pelarut tersebut (Meyer, 2004). Oleh sebab itu, kekuatan elusi fase gerak mempengaruhi pula nilai k. Semakin kuat suatu komposisi fase gerak, semakin kecil nilai k puncak analit yang dihasilkan (Snyder et al., 2010). Kombinasi metanol atau asetonitril dengan air berguna untuk mengatur pemisahan analit yang lebih baik dibandingkan bila fase gerak hanya terdiri dari air.
Gambar 15. Pengaruh komposisi asetonitril, metanol, dan tetrahidrofuran dalam air terhadap kekuatan elusinya pada KCKT fase terbalik (Meyer, 2004)
Tabel V. Deret eluotropik dan nilai UV cut-off pelarut KCKT (Meyer, 2004) Komponen fase gerak Kekuatan /εº Polaritas /P’ Dipolaritas
/π* Keasaman /α Kebasaan /β UV off (nm)
cut-Asetonitril 0,50 5,8 0,60 0,15 0,25 190
Metanol 0,73 5,1 0,29 0,43 0,29 205
Air Lebih
Gambar 16. Segitiga selektivitas fase gerak KCKT (Snyder et al., 2010)
Walaupun dengan mengubah perbandingan komponen fase gerak dapat mengubah indeks polaritas (Lampiran 4) dan mempengaruhi kekuatan elusi dan nilai k, tetapi perubahan tersebut tidak selektif, sehingga bila terdapat puncak yang sangat menumpuk, bisa saja puncak tersebut terus menumpuk meskipun polaritas fase gerak telah diubah secara signifikan. Pada kasus ini, akan lebih baik mengubah selektivitas pelarut agar terjadi pemisahan yang baik. Terdapat dua cara yang biasanya dilakukan, yang pertama yaitu mengubah jenis pelarut pada fase gerak. Segitiga selektivitas fase gerak dapat menjadi panduan untuk memilih pelarut tersebut (Harvey, 2000).
Pada Gambar 16, dapat dilihat segitiga selektivitas fase gerak KCKT yang dibuat berdasarkan nilai dipolaritas (π*), keasaman (α), dan kebasaan (β)
masing-masing pelarut (Tabel V). Dipolaritas adalah ukuran kemampuan pelarut berinteraksi dengan analit dengan kekuatan dipol dan polarisasi. Keasaman adalah ukuran kemampuan pelarut untuk bertindak sebagai pendonor ikatan hidrogen terhadap analit basa (akseptor), sebaliknya kebasaan adalah ukuran kemampuan
pelarut untuk bertindak sebagai akseptor ikatan hidrogen terhadap analit asam (pendonor). Segitiga selektivitas tersebut menggambarkan bahwa pemilihan kombinasi pelarut fase gerak lebih tepat bila dipilih pelarut yang tidak berada pada area yang berdekatan supaya diperoleh selektivitas yang diinginkan (Meyer, 2004). Oleh sebab itu, dipilih pelarut asetonitril (ACN) yang merupakan pelarut yang bersifat dipolar, serta metanol dan air yang bersifat sebagai pendonor H untuk digunakan dalam pemisahan PPD untuk memodifikasi selektifitas fase gerak agar pemisahan dapat berjalan dengan baik. Asetonitril yang bersifat dipolar karena memiliki dipol positif pada atom C dari gugus nitril dapat berinteraksi secara dipolar dengan PPD yang memiliki dipol negatif pada atom N. Metanol dan air yang bersifat sebagai pendonor H dapat berinteraksi dengan PPD yang bersifat basa (akseptor H).
Gambar 17. Distribusi bentuk molekul PPD dalam berbagai pH (ChemAxon, 2014)
Cara kedua untuk mengubah selektivitas fase gerak adalah dengan mengubah pH. Analit yang bersifat asam lemah atau basa lemah akan berubah mekanisme retensinya secara signifikan bila pH fase gerak diubah (Harvey, 2000).
Senyawa PPD merupakan analit yang dapat terionisasi pada pH tertentu (Gambar 17), sehingga pada pemisahannya menggunakan KCKT diperlukan dapar dalam fase gerak agar dapat mempertahankan pH dan menghasilkan retensi yang reprodusibel selama pemisahan (Snyder et al., 2010).
Tujuan pengubahan pH fase gerak adalah untuk mengamati pengaruh pH pada pemisahan PPD menggunakan polaritas kolom tertentu. Pengaturan pH juga penting pada pemisahan PPD menggunakan KCKT karena kecepatan pembentukan produk oksidasi PPD (Bandrowski’s base) dipengaruhi pula oleh peningkatan pH. Kecepatan oksidasi PPD meningkat pada pH > 8,5 (Corbett, 1972). Pada beberapa kombinasi komposisi fase gerak ditambahkan pula asam asetat 0,05 M dan asam formiat dengan tujuan untuk mengatur pH fase gerak pada suasana asam (± pH 5); dapar fosfat pH 7 pada suasana netral (± pH 7); amonia 10% pada suasana basa (± pH 8).
Nilai UV cut-off adalah panjang gelombang UV pelarut yang akan memberikan serapan lebih dari 1,0 satuan absorbansi dalam kuvet 1 cm sehingga dianjurkan untuk tidak menggunakan pelarut yang memiliki nilai UV cut-off bertepatan atau mendekati panjang gelombang deteksi analit (Gandjar dan Rohman, 2007). Air, metanol, dan asetonitril berturut-turut memiliki nilai UV cut-off 170 nm, 205 nm, dan 190 nm (Tabel V) sehingga tidak mengganggu pembacaan analit karena penelitian ini menggunakan detektor spektrofotometer UV pada panjang gelombang cukup jauh dari nilai UV cut-off pelarut yaitu, 254 nm.
Viskositas fase gerak dapat mempengaruhi tekanan dan efisiensi kolom. Semakin tinggi viskositas, semakin tinggi pula tekanan pada kolom, sebaliknya semakin kecil nilai N. Maka dari itu, viskositas yang baik untuk fase gerak adalah viskositas yang sekecil mungkin. Viskositas air, metanol, dan asetonitril berturut-turut sebesar 0,89; 0,54; dan 0,34 cP. Kombinasi ketiga senyawa tersebut dapat mempengaruhi viskositasnya. Tabel VI menyajikan data viskositas kombinasi fase gerak antara metanol dan air serta asetonitril dan air dalam satuan cP pada berbagai suhu.
Tabel VI. Viskositas kombinasi fase gerak metanol:air (baris atas) dan asetonitril:air (baris bawah) pada suhu tertentu (B = komposisi organik) (Snyder et al., 2010)
Partikel-partikel pengotor dalam fase gerak harus dihilangkan karena dapat mengganggu proses analisis dan pembacaan analit karena partikel tersebut dapat menyumbat pori-pori kolom. Oleh karena itu, fase gerak harus disaring menggunakan kertas Whatman terlebih dahulu sebelum digunakan. Keberadaan gas dalam fase gerak juga dapat mengganggu pembacaan analit (Gandjar dan Rohman, 2007). Fase gerak di-degassing (dihilangkan gasnya) dengan ultrasonifikator selama 20 menit.