PCR-RFLP

PERAIRAN PESISIR PULAU JAWA BERDASARKAN MARKA GEN CO1

Metode PCR-RFLP digunakan untuk mengetahui perbedaan profil ukuran fragmen DNA dari individu yang berbeda (Hansen et al. 1997) dengan menggunakan enzim restriksi EcoR1. Tahapan yang dilakukan yaitu dengan mencampur 15,5 μL ddH2O, 2 μL produk PCR, dan 0,5 μL enzim restriksi yang dicampurkan di dalam tube. Setelah itu campuran diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 jam. Campuran yang telah diinkubasi kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1,2 % dengan tegangan 100 V selama 45 menit. Visualisasi hasil pemotongan menunjukkan pola fragmen yang khas berdasarkan enzim restriksi.

Analisis Data

Analisis genetik diantaranya 1) jarak genetik untuk mengetahui besar perbedaan basa nukleotidamimidari masing-masing wilayah dengan menggunakan software MEGA 5.0, 2) pohon filogeni untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies dengan software MEGA 5.0, 3) Analisis keanekaragaman haplotipe (h) Lampiran 2.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Amplifikasi Fragmen DNA Gen CO1 Mimi

Metode PCR telah digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA gen CO1 pada suhu annealing 52oC. Panjang urutan basa nukleotida yang berhasil teramplifikasi yaitu 700 bp (Gambar 19). Produk PCR yang berkualitas baik dapat dilanjutkan pada tahap pemurnian dan sekuensing.

Gambar 19 Visualisasi DNA hasil pre-test produk PCR pada gel agarosa 0,8 %. Kolom kiri sampai kanan: marker 1 kb, 1) Tt SBG, 2) Cr SBG, 3) Tg SMG, 4) Tt SMG, 5) Tg DMK, 6) Cr DMK, 7) Cr RMG, 8) Tg SRB, 9) Tg SBG, 10) Tg BTN

Sekuensing DNA dan Pensejajaran Urutan Basa Nukleotida Gen COI Mimi

Hasil sekuensing disejajarkan dengan primer forward dan reverse. Analisis jarak genetik dan konstruksi pohon filogeni dilakukan dengan menggunakan software MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Komposisi basa nukleotida C. rotundicauda terdiri dari 34,8% basa timin (T), 28,1 % basa adenin (A), 21,2% basa sitosin (C) dan 15,9% basa guanin (G). Sedangkan pada T. tridentatus terdiri dari 34% basa timin (T), 27,1 % basa adenin (A), 23,2% basa sitosin (C) dan 15,7% basa guanin (G). Begitu juga dengan T. gigas terdiri dari 33,9% basa timin (T), 27,1 % basa adenin (A), 23,2% basa sitosin (C) dan 15,8% basa guanin (G) (Lampiran 3). Sehingga gen COI pada ketiga spesies mimi dikategorikan sebagai kelompok kaya akan A-T.

Pensejajaran sekuen nukleotida gen COI ke-3 spesies menghasilkan nilai conserved sebesar 71,8% (390/543), variabel sebesar 12,3% (67/543), dan singleton 0,6% (3/543). Nilai variabel menunjukkan bahwa terdapat variasi basa nukleotida yang merupakan karakteristik pembeda dari ketiga spesies.

Nukleotida Spesifik dan Mutasi Gen COI Mimi

Sekuen nukleotida gen COI disejajarkan dan diperoleh sebanyak 67 situs spesifik pada mimi. Ke-67 situs spesifik ini merupakan penciri yang membedakan ketiga spesies C. rotundicauda, T. gigas, dan T. tridentatus (Lampiran 4). Sebanyak 1 situs spesifik antar spesies C. rotundicauda, 4 situs spesifik antar spesies T. gigas, dan 1 situs spesifik antara T. tridentatus yang membedakan antar masing-masing spesies. Hal ini menunjukkan adanya evolusi spesifik dari ketiga spesies tersebut.

Berdasarkan hasil pensejajaran sekuen nukleotida gen CO1 diperoleh situs mutasi. Situs mutasi hanya ditemukan pada spesies T. gigas dan T. tridentatus yaitu delesi sebanyak 1 pada situs ke 107, sedangkan insersi tidak ditemukan.

Jarak Genetik dan Konstruksi Pohon Filogeni Mimi

Jarak genetik berdasarkan marka gen CO1 antara spesies pada famili Limulidae yang dikaji di perairan pesisir Utara Jawa dengan spesies dari GenBank ditampilkan pada Tabel 8. Spesies yang diperoleh dari GenBank berasal dari perairan Laut Arab dan Sweden.

Tabel 8 Matriks jarak genetik fragmen gen CO1 pada tiga spesies mimi (Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleus tridentatus, dan T. gigas) dari famili Limulidae dari Banten, Subang, Semarang, Demak, Rembang, dan Surabaya Spesies_lokasi Cr _DMK_RMG^Cr _SBG^Cr _BTN^Tg _SBG^Tt _SBG^Tg _DMK^Tg _SMG^Tg _SRB^Tg _SMG^Tt _HQ588752^Tt _KJ825849^Tg Cr DMK Cr RMG 0,002 Cr SBG 0,002 0,000 Tg BTN 0,140 0,138 0,138 Tt SBG 0,143 0,140 0,140 0,009 Tg SBG 0,140 0,138 0,138 0,000 0,009 Tg DMK 0,140 0,138 0,138 0,007 0,002 0,007 Tg SMG 0,140 0,138 0,138 0,007 0,002 0,007 0,000 Tg SRB 0,143 0,140 0,140 0,009 0,004 0,009 0,002 0,002 Tt SMG 0,140 0,138 0,138 0,007 0,002 0,007 0,000 0,000 0,002 Tt HQ588752 0,129 0,127 0,127 0,088 0,090 0,088 0,088 0,088 0,090 0,088 Tg KJ825849 0,136 0,134 0,134 0,015 0,018 0,015 0,015 0,015 0,018 0,015 0,086

Keterangan: Cr: C. rotundicauda, Tt: T. tridentatus, Tg: T. gigas, DMK: Demak, RMG: Rembang,

SBG: Subang, BTN: Banten, SMG: Semarang, SRB: Surabaya, HQ588752: Sweden KJ825849: Central Arabian Sea.

Nilai jarak genetik terendah antara spesies Indonesia dengan spesies outgroups yaitu 0,015 pada Tg BTN, Tg SBG, Tg DMK, Tg SMG, Tt SMG dengan T. gigas_KJ825849, sedangkan jarak tertinggi pada Cr DMK dengan T. gigas_KJ825849 yaitu sebesar 0,136.

Jarak genetik fragmen gen CO1 pada tiga spesies mimi yaitu terendah 0,000 antara spesies Cr RMG-Cr SBG, Tg BTN-Tg SBG, Tg Tg SMG, Tg DMK-Tt SMG, Tg SMG-DMK-Tt SMG. Jarak genetik terendah antar spesies C. rotundicauda yaitu sebesar 0,000 pada lokasi RMG dan SBG, jarak tertinggi 0,002 pada daerah DMK-RMG dan DMK-SBG. Jarak genetik terendah spesies T. gigas yaitu 0,000 BTN-SBG dan DMK-SMG, tertinggi yaitu 0,009 yaitu BTN-SRB dan SBG-SRB. Jarak genetik antara spesies T. tridentatus SBG dan SMG yaitu 0,002.

Jarak genetik digunakan untuk membentuk pohon filogeni, dari pohon ini dapat diketahui hubungan kekerabatan antar spesies. Pohon filogeni dikonstruksi berdasarkan metode p-distance. Hasil analisis filogeni diperoleh pemisahan yang nyata antara spesies Indonesia dengan spesies outgroups (Gambar 20). Kelompok T. tridentatus teridentifikasi identik dengan T. gigas sedangkan C. rotundicauda memiliki karakter nukleotida yang berbeda (distinct) dibandingkan dengan outgroup.

Gambar 20 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan gen CO1 pada tiga spesies mimi (Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleus tridentatus, dan T. gigas) dari famili Limulidae

Keragaman Haplotipe Mimi

Diperoleh sebanyak 7 jumlah haplotipe dari tiga spesies yang berasal dari 10 lokasi, dengan C. rotundicauda sebanyak 2 haplotipe dari 3 individu yang berasal dari Demak, Rembang, dan Subang. T. gigas memiliki 3 haplotipe dari 5 individu yang berasal dari Banten, Demak, Subang, Semarang, dan Surabaya. T. tridentatus memiliki 2 haplotipe dari 2 individu yang berasal dari Semarang dan Subang. Tabel 9 Keragaman haplotipe pada tiga spesies mimi (Carcinoscorpius

rotundicauda, Tachypleus tridentatus, dan T. gigas) dari Banten, Subang, Semarang, Demak, Rembang, dan Surabaya

Spesies ∑ haplotipe (∑ individu) Lokasi

C. rotundicauda 2 (3) DMK, RMG, SBG

T. gigas 3 (5) BTN, DMK, SBG, SMG, SRB

T. tridentatus 2 (2) SMG, SBG

Pemotongan dengan enzim restriksi

Pemotongan dengan menggunakan enzim restriksi EcoR1 menghasilkan 8 jenis digesti yaitu tipe A, B, C, D, E, F, G, dan H. Tipe A dan B terjadi pada spesies T. gigas dan tipe B dan H pada T. tridentatus, sedangkan tipe C, D, E, F, G terjadi pada spesies C. rotundicauda. Tipe restriksi dengan panjang basa A (720 bp), B (250, 450, 720 bp), C (100, 250, 450, 650, 720 bp), D (100, 650, 720 bp), E (100, 450, 650, 720 bp), F (450, 650, 720), G (650, 720), H (450,750). Variasi hasil pemotongan pada beberapa sampel dapat dilihat pada Gambar 21, 22, dan 23 dengan ilustrasi tipe digesti pada Gambar 24.

T. tridentatus Subang T. gigas Surabaya T. tridentatus Semarang T. gigas Semarang T. gigas Demak T. gigas Banten T. gigas Subang KJ825849 T. gigas HQ588752 T. tridentatus C. rotundicauda Demak C. rotundicauda Rembang C. rotundicauda Subang

Gambar 21 Hasil digesti fragmen mtDNA oleh enzim restriksi EcoRI. 1= Marker, 2-6= Tg Demak, 7-10= Tg Subang, 11-13= Tg Semarang

Gambar 22 Hasil digesti fragmen mtDNA oleh enzim restriksi EcoRI. 1= Marker, 2-8= Cr Demak, 9-13= Cr Subang

Gambar 23 Hasil digesti fragmen mtDNA oleh enzim restriksi EcoRI. 1= Marker, 2-5= Cr Rembang, 6-10= Tt Subang, 11= Tt Semarang, 12= Tg Surabaya, 13= Tg Banten

Gambar 24 Ilustrasi tipe digesti yang terbentuk dari ke-3 spesies mimi (Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleus tridentatus, dan T. gigas)

Pemotongan dengan menggunakan enzim restriksi EcoR1 pada tiga spesies menghasilkan 5 alel dan keanekaragaman haplotipe yang berbeda-beda. C. rotundicauda memiliki total variasi haplotipe sebanyak 5 haplotipe, T. gigas memiliki total variasi haplotipe 2, begitu juga T. tridentatus memiliki total variasi haplotipe 2 (Tabel 10). Keanekaragaman haplotipe pada spesies tertinggi C. rotundicauda yaitu pada lokasi Demak sebesar 0.8372, pada T. gigas yaitu lokasi Subang sebesar 0.8095, dan daerah Semarang untuk spesies T. tridentatus yaitu sebesar 1.

Tabel 10 haplotipe ketiga spesies mimi (Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleus tridentatus, dan T. gigas)

Spesies Lokasi Jumlah _sampel^Jumlah_alel _haplotipe^Jumlah _haplotipe^Tipe ^h^{(keanekaragaman}_haplotipe) C. rotundicauda Rembang 4 3 2 D, G 0.6548 Subang 5 5 3 C, D, G 0.7867 Demak 7 5 4 C, D, E, F 0.8372 T. gigas Demak 5 ₃ ₂ A, B 0.4889 Subang 4 3 2 A, B 0.8095 Semarang 3 3 2 A, B 0.4889 Banten 1 3 1 B 0.6667 Surabaya 1 - - - - T. tridentatus Subang 5 3 1 B 0.3704 Semarang 1 2 1 H 1.0000 Pembahasan

Perbedaan beberapa situs gen CO1 urutan basa nukleotida berdasarkan hasil dari jarak genetik menunjukkan adanya mutasi pada mimi. Terdapat satu situs yang termutasi delesi yaitu pada situs ke 107 pada spesies T. tridentatus dan T. gigas. Gen tersebut sedikit mengalami delesi dan insersi dalam sekuennya, serta variasi

yang sedikit (Hebert et al. 2003). Urutan nukleotida bersifat conserve pada tingkat spesies, hal ini ditunjukkan oleh sekuen nukleotida pada gen CO1 mimi. Keberadaan 67 situs nukleotida spesifik menjadi penciri spesies mimi, yang menunjukkan adanya evolusi spesifik pada mimi.

Basa nukleotida ketiga spesies tersebut didominasi oleh ikatan basa adenin (A) dan timin (T). Yusuf (2011) menyatakan bahwa A-T memiliki ikatan hidrogen yang terdiri dari dua ikatan dan bersifat lemah dibandingkan dengan G-C yang memiliki tiga ikatan hidrogen. Sehingga, A-T lebih mudah terpisah dan menyebabkan ketiga spesies mimi memiliki kemungkinan mutasi yang cukup tinggi. Bila mutasi berjalan terus menerus dari generasi ke generasi maka pada suatu saat akan muncul turunan baru yang sifatnya berbeda dengan moyangnya, sehingga terjadilah peristiwa evolusi (Brown et al. 1979). Selain itu, mutasi yang cukup tinggi ini dapat memiliki pengaruh menguntungkan, merugikan, atau netral pada suatu populasi. Hal ini tergantung pada meningkatkan atau menurunkan variasi genetik, karena mutasi dapat meningkatkan atau menurunkan fitness suatu spesies (Soewardi 2007).

Spesies C. rotundicauda tidak terjadi mutasi dan memiliki jarak genetik sangat jauh terhadap genus Tachypleus, menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Obst et al. (2012) dengan menggunakan fragmen gen 16S, 28S, dan CO1 diperoleh hasil bahwa konstruksi pohon filogeni C. rotundicuada terpisah dengan genus Tachypleus, C. rotundicuada merupakan spesies yang memiliki keragaman genetik paling tinggi dibandingkan dengan genus Tachypleus dan Limulus, hal ini disebabkan oleh perbedaan faktor ekologi C. rotundicuada yang berhabitat di estuari dan mangrove. Wilayah ini merupakan wilayah yang lebih tertutup dibandingkan lautan terbuka, sehingga gene flow antara populasi spesies ini lebih terbatas (Obst et al. 2012).

Konstruksi pohon filogeni spesies C. rotundicauda, T. gigas, dan T. tridentatus dengan spesies outgropus, menunjukkan adanya pemisahan yang nyata. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga spesies tersebut memiliki karakter nukleotida yang berbeda dibandingkan dengan outgroups (negara lain). Namun, pada penelitian ini T. tridentatus memiliki nukleotida yang identik dengan T. gigas berdasarkan hasil. Sedangkan spesies C. rotundicauda belum teridentifikasi secara genetik. Menurut Wodajo (2015) DNA-barcoding memiliki beberapa keterbatasan diantaranya yaitu resolusi rendah untuk beberapa kasus (hibridisasi, penyimpangan spesies baru, dan kompleks spesies). Penyebab utama keterbatasan DNA-barcoding yaitu berasal dari sistem identifikasi lokus tunggal (single-locus identification system). Hal ini diperkuat oleh penelitian yang dilakukan oleh Kemppainen et al. (2009) yang menyatakan bahwa sekuen DNA mitokondria dan kloroplas yang identik dapat terjadi pada spesies berbeda yang masih saling berkaitan karena adanya introgresi (introgression) atau tidak lengkapnya menyortir garis keturunan (incomplete lineage sorting) pada saat spesiasi (speciation). Diperkuat oleh Sutrisno et al. (2013) meskipun gen CO1 telah dipilih menjadi satu gen yang sekuennya digunakan dalam barcode dan memiliki kelebihan. Namun tidak semua kelompok dapat menggunakan CO1 dalam analisis DNA barcode, karena belum tentu mendapat hasil yang memuaskan. Gen CO1 tidak dapat digunakan dalam kelompok tertentu. Hal ini terkait dengan beberapa kelemahan gen CO1 diantaranya yaitu gen CO1 tidak bervariasi dalam beberapa kelompok takson tertentu. Gen CO1 mungkin tidak mampu menyelesaikan perbedaan tingkat spesies disemua

37 subkelompok dari kelompok takson dan data sekuen. Tambahan mungkin diperlukan dari suatu wilayah kedua atau bahkan ketiga dalam kasus tersebut.

Setiap spesies menghasilkan pemotongan oleh enzim restriksi yang berbeda-beda dan memiliki jumlah haplotipe yang berberbeda-beda-berbeda-beda. Menurut Rina (2001), adanya pemotongan yang berbeda pada tiap individu maupun antar populasi merupakan hal yang menunjukkan adanya keragaman genetik di dalam populasi dan antar populasi. C. rotundicuada Demak, T. gigas Subang, dan T. tridentatus Semarang memiliki keanekaragaman haplotipe tertinggi jika dibandingkan dengan lokasi lain. Populasi dengan keragaman genetik yang tinggi mempunyai peluang hidup yang lebih baik untuk beradaptasi dengan lingkungannya (Rina 2001).

Keragaman genetik ketiga spesies mimi relatif kecil yang ditunjukkan dengan adanya jumlah haplotipe hasil RFLP dan sekuensing serta jarak genetik hasil sekuensing. Hal ini manunjukkan adanya sumber genetik yang sama. Jumlah haplotipe tiap spesies berbeda, tertinggi pada hasil skuensing yaitu pada spesies T. gigas, sedangkan pada hasil RFLP tertinggi pada spesies C. rotundicauda. Haplotipe terbentuk akibat adanya perubahan salah satu nukleotida dari suatu spesies. Diduga telah terjadi pertukaran genetik karena siklus hidup mimi pada saat larva yaitu planktonik. Menurut Arruda et al. (2009) keragaman genetik dipengaruhi oleh karakteristik lingkungan seperti letak geografis, bentuk perairan dan besar arah arus. Struktur genetika dan tingkat keanekaragaman suatu populasi dipengaruhi oleh mekanisme genetik secara internal maupun eksternal. Faktor yang dapat menyebabkan peningkatan keragaman genetik yaitu faktor mutasi dan migrasi, sedangkan faktor-faktor yang menurunkan keragaman genetik yaitu seleksi alam, silang dalam (inbreeding) serta penghanyutan gen (genetic drift) (Gardner et al. 1991).

C. rotundicauda memiliki alel paling banyak dan keanekaragaman haplotipe paling tinggi. Khusunya pada daerah Demak, sehingga dapat dikatakan bahwa Demak memiliki lebih kaya genetik untuk spesies C. rotundicauda dibandingkan dengan lokasi lain. Begitu juga dengan T. gigas Subang dan T. tridentatus Semarang. Keragaman hayati memiliki peranan penting untuk keseimbangan ekosistem, demikian pula keragaman genetik. Semakin tinggi keragaman genetik, maka semakin tinggi populasi yang mampu bertahan hidup dalam jangka waktu yang lebih lama, karena semakin tinggi daya adaptasi populasi terhadap perubahan lingkungan. Dengan demkian, keragaman genetik merupakan kunci penting dalam memelihara keberlanjutan dan kinerja produksi dari suatu spesies (Slamat 2009). Sehingga Demak dapat ditentukan sebagai daerah gen stok untuk spesies C. rotundicauda, Subang sebagai gen stok T. gigas, dan Semarang untuk T. tridentatus. Keanekaragaman populasi dapat dipertahankan dengan cara mempertahankan jumlah populasi, serta yang terpenting adalah mempertahankan kondisi lingkungan agar tetap dalam kondisi baik.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Identifikasi molekuler T. gigas dari penelitian ini telah menunjukkan kepastian taksonomi (taxonomy certainty). Identifikasi spesies T. tridentatus dan C. rotundicauda tidak berhasil dengan menggunakan gen CO1. T. tridentatus identik dengan T. gigas, sedangkan C. rotundicauda perlu dilakukan analisis ulang. PCR-RFLP dengan menggunakan primer F1 dan F2 dapat diaplikasikan pada ketiga spesies mimi dan penggunaan enzim restriksi EcoR1 dapat memberikan hasil pemotongan pita DNA hasil PCR-RFLP. Demak dapat ditentukan sebagai daerah gen stok untuk spesies C. rotundicauda, Subang sebagai gen stok T. gigas, dan Semarang untuk T. tridentatus.

Saran

Penggunaan sampel darah sangat mudah dilakukan pada ketiga spesies mimi, namun hasil dengan menggunakan sampel darah sering mengalami kontaminasi. Sehingga, sebaiknya menggunakan sampel otot daging dan kit komersial yang memiliki kualitas baik sehingga diperoleh hasil yang baik serta menggunakan lebih dari satu gen.

DAFTAR PUSTAKA

Arruda CCB, Beasley CR, Vallinoto M, Silva NSM, Tagliaro CH. 2009. Significant genetic differentiation among population of Anomalocardia brasiliana (Gmelin 1791): A bivalve with planktonic larval dispersion. Genetics and Molecular Biology. 32(2):423-430.

Balisani SL. 1994. Studi perkembangan embrio blangkas Carcinoscorpius Rotundicauda (Latreille) hasil pemijahan semi alami dan buatan [Skrpisi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Brown WM, Matthew G, JR., and Allan CW. 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76(4):1967-1971.

Beekey MA, Mattei JH, Pierce BJ. 2013. Horseshoe crab eggs: A rare resource for predators in Long Island Sound. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 439:152-159.

Chatterji A, Vijayakumar R, Parulekar AH. 1992. Spawning migration of the horseshoe crab, Tachypleus gigas (Muller), in relation to lunar cycle. Asian Fisheries Science. 5:123-128.

Chiu, H.M.C. & B. Morton. 2004. The behavior of juvenil horseshoe crabs, Tachypleus tridentatus (Xiphosura), on nursery beach at Shin Hau Wan, Hong Kong. Hydrobiologia. 523:29-35.

39 Christianus A, Saad CR. 2007. Horseshoe crabs in Malaysia and the world. Fishery

Mail.16:8-9.

Dietl J, Nascimento C, Alexander R. 2000. Influence of ambient flow around the horseshoe crab Limulus polyphemus on the distribution and orientation of selected epizoans. Estuaries. 23:509-520.

Ding JL, Tan KC, Thangamani S, Kusuma N, Seow WK, Bui THH, Wang J, Ho B. 2005. Spatial and temporal coordination of expression of immune response genes during Pseudomonas infection of horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda. Nature Publishing Group. 6(7):557-574.

Eidman M, Mayunar, Redjeki S. 1997. Pematangan gonad mimi ranti, Carcinoscorpius rotundicauda (Latreille) dan mimi bulan Tachypleus gigas (Muller) dengan berbagai jenis pakan. Jurnal Ilmu-Ilmu Perairandan Perikanan Indonesia. 5(1):1-6.

Eidman M, Samosir AM, Aktani U. 1992. Studi Biologi Mimi/ Belangkas (Subkelas Xiphosura) dalam Rangka Perngembangan dan Pemanfaatan Sumberdaya Hayati Laut untuk Kebutuhan Industri Farmasi di Indonesia. Laporan Peneliti Tahun I. Proyek Pengembangan Pendidikan Ilmu Kelautan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Fakultas Perikanan. IBP, Bogor. Fachrul MF. 1989. Aspek Biologi Mimi (Xilphosura). Term Paper Fakultas Pasca

Sarjana Institut Pertanian, Bogor.

Ferari KM, Targett NM. 2003. Chemical attractants in horseshoe crab, Limulus polyphemus, eggs: the potential for an artificial bait. Journal of Chemical Ecology. 29:477-496.

Gardner EJ, Simmon MJ, Snustad PD. 1991. Population and EvolutionaryGenetics. Chichester Brisbane, New York.

Harrington BA. 2001. Red Knot (Calidriscanutus). In The Birds of North America, No. 563 (A. Poole and F. Gill, eds.). The Birds of North America, Inc., Philadelphia, Pennsylvania.

Hebert PDN, Ratnasingham S, De Waard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society. 270:96-99.

Hu M, Wang Y, Chen Y, Cheung SG, Shin PKS, Li Q. 2009. Summer distribution and abundance of juvenile Chinese horseshoe crabs Tachypleus tridentatus along an intertidal zone in Southern China. Aquatic Biologi. 7:107-112. Hurton L. 2003. Reducing post-bleeding mortality of horseshoe crabs (Limulus

polyphemus) used in the biomedical industry [Thesis]. Virginia (US): Virginia Polytechnic Institute and State University.

[IUCN] International Union for Conservation of Nature. 2015. Red list of threatened species. www. Iuc-nredlist.org. 18 Mei 2015. Pukul. 18.27 WIB. Irham M & Yuli SF. 2013. DNA Barcode Fauna Indonesia. Jakarta (ID):

KENCANA Prenadamedia Group.

Ismurwanti C. 1994. Studi awal pengaruh konsentrasi diazinon-60 EC terhadap perkembangan embrio dan penetasan telur mimi ranti Carcinoscorpius rotundicauda (Latreille) [Skrpisi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. John BA, Kamaruzzaman BY, Jalal KCA, Zaleha K. 2012. Feeding ecology and

food preferences of Carcinoscorpius rotundicauda collected from the Pahang nesting grounds. Sains Malaysiana. 41(7):855-861.

Lee CN, Morton B. 2005. Experimentally derived estimates of growht by juvenile Tachypleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda (Xiphosura) from nursery beaches in Hong Kong. Jurnal Marine Biology Ecology. 318:39-49. Li HY. 2008. The conservation of horseshoe crabs in Hong Kong [Tesis]. Hong

Kong (HK): City Universitas of Hong Kong.

Kemppainen P, Panova M, Hollander J, Johannesson K. 2009. Complete lack of mitochondrial divergence between two species of NE Atlantic marine intertidal gastropods. JournalofEvolutionary Biology. 22:2000-2011. Muslihah. 2004. Beberapa Aspek Biologi Reproduksi Mimi Bulan Tachypleus

gigas di Perairan Mayangan, Kabupaten Subang, Jawa Barat [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Mishra JK. 2009. Horseshoe crabs, their eco-biological status along the northeast coast of India and the necessity for ecological conservation. In: Tanacredi JT et al. (eds). 2009. Biology and conservation of horseshoecrabs. Springer Science & Business Media. 89-96.

Novitsky TJ, Thomas, Dawson, Michael E, Paus, Erik J. 2002. Artificial bait. United States Patent: 639-1295.

Novitsky TJ. 1994. Limulus amebocyte lysate (LAL) detection of endotoxin in human blood. Journal of endotoxin research. 1(4):253-263.

Obst M, Faurby S, Bussarawit S, Funch P. 2012. Molecular phylogeny of extant horseshoe crabs (Xiphosura, Limulidae) indicates Paleogene diversification of Asian species. Molecular Phylogenetics and Evolution. 62(1):21-26. Purnomo YA. 1992. Biologi reproduksi mimi ranti Carcinoscorpius rotundicauda

(latreille) betina yang tertangkap di perairan Rembang, Jawa Tengah [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Rahmalia E. 1995. Pembuahan buatan dan studi awal pengaruh konsentrasi saponin terhadap perkembangan embrio dan larva mimi bulan Tachypleus gigas (Muller) [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Rina. 2001. Keragaman genetik ikan pangasius Indonesia bedasarkan analisis mtDNA dengan teknik PCR-RFLP [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Rubiyanto E. 2012. Studi populasi mimi (Xiphosura) di perairan Kuala Tungkal Kabupaten Tanjung Jabung Barat, Jambi [Tesis]. Depok (ID): Universitas Indonesia.

Santoso AR. 1992. Pemijahan dan perkembangan embrio mimi Tachypleus gigas (Muller) [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Selander RK, Yang SY, Lewontin RC, Johnson WE. 1970. Genetic variation in the horseshoe crab (Limulus polyphemus), a phylogenetic ‘‘relic’’. Evolution. 24(2):402-414

Shin P, Li HY, Cheung SG. 2009. Horseshoe crabs in Hong Kong: Current population status and human exploitation. In: Tanacredi JT et al. (eds). 2009. Biology and conservation of horseshoe crabs. Springer Science & Business Media. 347-360.

41 Slamat. 2009. Keanekaragaman genetik ikan betok (Anabas testudineus, Bloch) pada tiga ekosistem perairan rawa di Provinsi Kalimantan Selatan [Tesis]. Bogor (ID): Intitut Pertanian Bogor.

Smith DR. 2007. Effect of horseshoe crab spawning density on nest disturbance and exhumation of eggs: a simulation study. Estuaries. 30:287-295.

Solihin DD. 1994. Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi keragaman genetik dan biologi populasi pada hewan. Hayati. 1(1):1-4.

Suparta. 1992. Keragaman sifat-sifat morfometrik mimi, Tachypleus gigas (MULLER) & Carcinoscorpius rotundicouda (LATREILLE) di perairan pantai Kabupaten Pandeglang, Jawa Barat dan perairan pantai Kabupaten Rembang, Jawa Tengah [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Sutrisno H, Muhammad SAZ, Sri S. 2013. DNA Barcode Fauna Indonesia. Jakarta

(ID): KENCANA Prenadamedia Group.

Taylor LC, Lee J, Hsu CC. 2011. Population structure and breeding pattern of the mangrove horseshoe crab Carcinoscorpius rotundicauda in Singapore. Aquatic Biology. (8):61-69.

Tudge C. 2000. The Variety of Life. New York (US): Oxford University Press. Vauziyah C. 1995. Perkembangan embrio mimi bulan Tachypleus gigas (Muller)

dari perairan Teluk Banten pada berbagai salinitas media [Skrpisi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Wodajo B. 2015. DNA-barcoding for taxonomical classification: it’s implication species Identification. International Journal of Multidisciplinary Research and Information. 1(1):63-74.

Walls EL, Berkson J, Smith SA. 2002. The Horseshoe Crab, Limuluspolyphemus: 200 million years of existence, 100 years of study. Review Fisheries Sciences.10:39-73.

Yeo DSA, Ding JL, Ho B. 1996. Neuroblastoma cell culture assay shows that Carcinoscorpius rotundicauda haemolymph neutralizes tetrodotoxin. Pergamon. 34(9):1054-1057.

4 PEMBAHASAN UMUM

Webster (2007) menyatakan bahwa alat yang efektif digunakan untuk mempelajari perubahan dan variasi bentuk tubuh suatu organisme yaitu melalui kajian morfometrik. Morfometrik merupakan salah satu bentuk mekanisme adaptasi terhadap perbedaan karakter habitat. Adaptasi morfologi yang dilakukan dapat

Dalam dokumen Kajian Morfologi Dan Genetik Mimi (Xiphosura, Limulidae) Sebagai Dasar Konservasi Dan Pengelolaan Di Pulau Jawa. (Halaman 46-67)