Sterilisasi Alat
Alat-alat dissecting-set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur in vitro dicuci dan dikeringkan. Kemudian bungkus tabung dengan plastik tahan panas atau letakkan pada rak tabung, sedangkan untuk botol biasanya bisa langsung diletakkan pada autoklaf. Disterilkan tabung/botol dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dan suhu 121oC selama 60 menit. Setelah itu sterilkan secara kering tabung/botol di dalam oven pada suhu 150oC selama 1-2 jam.
Pembuatan Media
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Murashige and Skoog (MS) padat. Sebelum dilakukan pembuatan media MS, dilakukan pembuatan larutan stok hormon BAP dan NAA. Larutan stok hormon masing-masing dibuat 100mg/100ml. Larutan stok BAP dan NAA disaring menggunakan minisar guna meningkatkan sterilitas dari hormon tersebut dan dilakukan di Laminar Air Flow Cabinet (LAFC).
Pada pembuatan media MS, tahap pertama adalah membuat larutan stok bahan kimia hara makro dengan pembesaran 10x, hara mikro dengan pembesaran 100x, larutan iron dengan pembesaran 50x, larutan vitamin dengan pembesaran 100x, sukrosa 50 g, myo-inositol 0,1 gr dan agar 5 gr. Tahap berikutnya, sukrosa dimasukkan ke dalam beaker glass yang telah berisi aquadest 1000 ml, lalu diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer sebagai pengaduk. Kemudian ditambahkan myo-inositol diaduk hingga larut. Dimasukkan larutan stok hara makro 100ml, larutan stok hara mikro 10ml, iron 20ml dan vitamin 10ml. Kemudian larutan ditempatkan menjadi 5000 ml. Keasaman diukur dengan pH
meter. pH yang dikehendaki adalah 5,8, ntuk mengatur pH yaitu menaikkan atau menurunkan pH dapat digunakan larutan NaOH dan HCl 0,1 N. Letakkan agar microbiology dan dimasak di atas kompor gas sampai larutan mendidih dan bening (semua agar telah larut). Larutan dipindahkan ke erlenmeyer berukuran 5000ml dan ditutup dengan aluminium foil. Hasil Media MS secara keseluruhan di sterilisasi dengan tekanan 1 atm pada suhu 121°C selama 1 jam 30 menit di autoklaf. Setelah proses sterilisasi selesai, media dimasukkan ke ruang kultur dan dimasukkan ke ruangan Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) untuk dibagikan ke 16 tabung erlenmeyer berukuran 500ml dengan masing-masing tabung berisi 250ml. Teteskan BAP dan NAA ke masing-masing tabung uji sesuai perlakuan. Lalu setiap perlakuan ditepatkan hingga masing-masing perlakuan menjadi 300ml. Dituangkan media ke dalam tabung uji berisikan 13ml/tabung dan ditutup kain kasa steril yang dibalut dan diikat benang. Sehingga didapat ± 23 tabung uji. Tabung uji diberi label sesuai dengan perlakuan. Selanjutnya disimpan dalam ruang kultur sebelum digunakan.
Sterilisasi Bahan Tanaman di Lapangan
Bahan tanaman berasal dari rumah kaca tanaman karet PT. Perkebunan Nusantara III, Kebun Gunung Pamela. Sterilisasi lapangan ialah dengan memberikan fungisida berbahan kimia mankozeb yang dicampurkan dengan air, dioleskan pada bahan tanaman yang akan dijadikan eksplan di rumah kaca. Ditunggu selama 1 malam untuk fungisida bereaksi mencegah jamur pada bahan tanaman. Dipotong bahan tanaman yang akan dijadikan eksplan dan diberi label sesuai dengan genotipe yang diambil.
Pengambilan Bahan Tanaman
Bahan tanaman yang digunakan ialah yang telah diberikan fungisida berbahan kimia mankozeb. Bahan tanaman yang digunakan ialah bibit karet yang telah latern (daun terbuka sempurna) dan berwarna hijau terang, batang tanaman kokoh dan berwarna hijau, serta berpayung dua. Batang bawah dari tanaman karet itu sendiri berasal dari seedling klon karet tertentu yang selanjutnya diokulasi menghasilkan genotipe 85 (kodefikasi genotipe dari Balai Penelitian Karet Sungei Putih). Bagian yang diambil ialah buku-buku entres yang digunakan sebagai bahan eksplan.
Sterilisasi Bahan Tanaman di Laboratorium
Sterilisasi di laboratorium ialah dengan mencuci bahan tanaman menggunakan air mengalir dengan menggunakan kuas untuk menghilangkan olesan dithane. Bilas eksplan dengan cara memasukkan eksplan ke dalam tabung toples kemudian diisi alkohol 70% dan diguncang selama 1 menit. Rendam eksplan ke dalam tabung toples berisi larutan H2O2 dengan konsentrasi 17% selama 20 menit. Setelah selesai larutan tersebut dibuang, tabung toples diisi aquadest dan diguncang selama 1 menit dan dibuang kembali. Rendam kembali eksplan dengan aquadest di dalam tabung toples selama 2 x 15 menit. Kemudian air tersebut dibuang dari tabung toples.
Persiapan Ruang Tanam
Seluruh permukaan laminar air flow cabinet sebelumnya dibersihkan terlebih dahulu dengan di lap menggunakan alkohol 96% lalu di sterilkan dengan sinar Ultra Violet selama 1 jam sebelum proses penanaman dilakukan. Semua alat dan bahan yang akan dipakai harus disemprot dengan alkohol 96% dan beberapa
alat seperti pinset, gunting, scalpel setelah disemprot lalu dibakar di dalam ke dalam laminar air flow cabinet selama 1 menit. Hal ini dilakukan untuk menghindari resiko bahan penelitian terkontaminasi. Steri box dihidupkan dan disediakan alkohol 70% untuk membersihkan alat yang telah digunakan.
Penanaman
Eksplan yang digunakan adalah nodus dari bahan tanaman karet yang telah di sterilisasi sebelumnya. Kemudian nodus-nodus disterilasi dengan standar yang dimiliki Laboratorium In Vitro Kebun Gunung Pamela, lalu langsung ditanam pada tabung uji yang sudah berisikan agar sebanyak 13 ml/tabung uji. Eksplan yang digunakan berukuran 2 – 2.5 cm, apabila ukuran eksplan belum sesuai maka dipotong menggunakan gunting steril dan tajam. Eksplan yang akan dikulturkan ke dalam media tanam diletakkan di piringan kaca tebal dengan alas kertas plano. Kemudian eksplan ditanamkan ke dalam tabung uji sesuai dengan perlakuan, setiap tabung uji terdiri dari 1 eksplan. Kemudian ujung tabung uji ditutup dengan menggunakan kain kasa steril yang dibalut dan diikat benang. Kegiatan penanaman dilakukan di LAFC dan di bawah api bunsen. Tabung uji diletakkan di rak kultur di bawah cahaya dan ruangan memiliki air conditioner dengan suhu 18oC.
Pemeliharaan Eksplan
Tabung-tabung uji diletakkan pada rak kultur di dalam ruang kultur. Ruangan ini diusahakan bebas dari bakteri dan cendawan, dimana setiap hari disemprot dengan alkohol 96% atau dan disemprot formalin agar bebas dari organisme yang menyebabkan terjadi kontaminasi. Dalam penelitian ini suhu ruangan kultur yang digunakan + 20-25°C, paling optimum 18oC dan intensitas
cahaya 2000 lux serta dengan kondisi ruangan memiliki air conditioner dengan hefa filter yang dibersihkan setiap 6 bulan sekali. Apabila mengalami kontaminasi, segera diambil dari rak kultur agar mencegah kontaminasi ke tabung lainnya.
Peubah Amatan
Persentase Munculnya Tunas (%)
Pengamatan dilakukan pada akhir percobaan berdasarkan jumlah tunas yang muncul dari keseluruhan ulangan.
Persentase munculnya tunas = jumlah daun yang terbentuk
jumlah eksplan seluruhnya (per perlakuan) x 100%
Jumlah Tunas (tunas)
Dihitung pada akhir penelitian dengan menghitung jumlah tunas baru yang terbentuk dari setiap eksplan dan jumlah tunas baru yang terbentuk dibagi dengan jumlah ulangan.
Panjang Tunas (cm)
Panjang tunas diukur pada tunas tertinggi dengan menggunakan kertas milimeter yang diukur dari tempat munculnya tunas (pangkal) sampai ujung tunas tertinggi. Panjang tunas keseluruhan dari setiap perlakuan dibagi dengan jumlah ulangan. Pengukuran dilakukan pada akhir penelitian.
Persentase Terbentuknya Daun (%)
Pengamatan dilakukan pada akhir percobaan berdasarkan jumlah daun yang terbentuk dari setiap eksplan.
Persentase terbentuknya daun = jumlah daun yang terbentuk
jumlah eksplan seluruhnya (per perlakuan) x 100%
Jumlah Daun (helai)
Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk yang telah terbuka sempurna pada eksplan yang dilakukan pada akhir percobaan.
Umur Muncul Tunas (hari)
Kemunculan tunas dihitung umur kemunculannya berdasarkan hari ke berapa munculnya tunas.
