METODOLOGI PENELITIAN
3.6. Pelaksanaan Penelitian
Perlakuan dimulai dengan menimbang berat badan masing-masing mencit dan diberi perlakuan sesuai dengan kelompok perlakuan. Bahan uji diberikan secara oral dengan menggunakan sonde yaitu alat suntik dengan jarum yang berujung tumpul sedikit membendol pada ujungnya. Jarum tumpul tersebut dimasukkan dengan hati-hati kira-kira sampai di lambung, setelah itu bahan uji dipompakan keluar. Volume pemberian bahan adalah 0,01L/Kg BB setiap hari selama 14 hari.
Kitosan yang diberikan ke mencit dalam bentuk larutan dengan pelarut asam asetat 1% dengan berat molekul rendah bersumber dari udang, molekul sedang bersumber dari kepiting dan molekul tinggi bersumber dari blankas. Konsentrasi larutan kitosan 1% dan 2%, untuk menjaga kesetabilan viskositas larutan maka larutan kitosan dibuat setiap pemberian perlakuan.
Satu hari setelah selesai perlakuan berat badan mencit ditimbang dan dimatikan secara dislokasi leher dan dibedah untuk diambil darahnya sebanyak 5 mL selanjutnya dianalisa kadar Pb dalam darah, aktivitas enzim -ALAD, dan kadar Hemoglobin.
3.6.1. Prosedur Pemeriksaan
Adapun prosedur pemeriksaan akan dilakukan penahapan sebagai berikut : Alat dan Bahan
Pengambilan sampel darah dilakukan dari jantung. Adapun alat dan bahan yang digunakan adalah : spuit 5 cc, tabung yang berisi heparin 0,01 mg sebagai antikoagulan.
Darah diambil sebanyak 5 ml dengan menggunakan spuit, dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi heparine dan disimpan pada suhu 40C (Wigfield & Farant, 1981).
3.6.2. Pembuatan larutan pereaksi untuk analisis enzim δ-ALAD Alat dan bahan
Alat yang digunakan dalam pembuatan larutan pereaksi yaitu: timbangan analitik; labu ukur 100 ml, , pH meter, gelas piala 250 ml, batang pengaduk, gelas ukur 50 ml dan 100 ml.
Bahan kimia yang digunakan adalah: Na2HPO4.12H2O; NaH2PO4.2H2O, -ALA; trikloro asetat (TCA), HgCl2, Triton X-100, p-dimethylaminobenzaldehyd, asam asetat glacial, asam perklorat, aquades.
Cara kerja
a. Larutan triton x-100
Sebanyak0,5 mL triton x-100 dicampur dengan 500 mL aquades. b. Larutan buffer natrium fosfat 0,2 mol/L pH 6,4
Sebanyak 53,72 g Na2HPO4.12H2O ditimbang dilarutkan dalam mL 500 mL aquades hingga 100 mL (Larutan A). NaH2PO4.2H2O 23,4 g dilarutkan dalam 500 mL aquades (Larutan B).Selanjutnya 100 mL Larutan A dicampur dengan 168 mL Larutan B, dilakukan pengukuran pH dengan menggunakan pH meter. Jika pH menunjukkan lebih besar dari 6,4, maka larutan ditambahkan asam fosfat sedikit demi sedikit hingga pH 6,4. sedang jika pH lebih rendah dari 6,4, maka larutan ditambah dengan larutan Na2PO4.
Sebanyak 209,5 mg -ALA dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml., dilarutkan dengan aquades hingga 100 mL, dikocok hingga homogen, dan disimpan pada suhu 40C.
d. Larutan trikloro asetat (TCA) 60 g/L yang mengandung HgCl2 60 mmol/L Sebanyak 15 g TCA dan 4 g HgCl2 dimasukkan ke dalam gelas piala dan ditambah dengan aquades sampai volumenya 250 mL.
e. Larutan pereaksi ehrlich
Sebanyak 2,0 g p-dimethylaminobenzaldehyd ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 60 ml asam asetat glasial. Selanjutnya ditambahkan 32 ml asam perklorat 70%. Sambil diaduk, tambahkan asam asetat sampai tepat 100 ml (Wigfield & Farant, 1981).
3.6.3. Prosedur penentuan aktivitas enzim -ALAD dalam darah Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penentuan aktivitas enzim -ALAD adalah: tabung mikro, mikro pipet, inkubator, sentrifugator dan spektrofotometer .
Bahan-bahan yang digunakan adalah: sampel darah, aquades, triton x-100, larutan buffer natrium fosfat 0,2 mol/l pH 6,4, larutan -ALA 125 mmol/L, larutan trikloro asetat (TCA) 60 g/L yang mengandung HgCl2 60 mmol/L ,larutan pereaksi ehrlich. Cara kerja
Pipet 20 μL sample darah dengan mikropipet, dimasukkan dalam tabung mikro tambahkan 100 μL larutan Triton X-100 campur selama 15 detik dan tempatkan campuran dalam ice-bath selama 3 menit untuk menyempurnakan lisis. Ke dalam hemolisat ditambahkan 100 μL buffer natrium fosfat pH 6,4 dan 100 μL larutan δ -Aminolevulinic acid kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 0C. Untuk blanko tambahkan 200 μL campuran larutan TCA merkuri klorida. Inkubasi semua sample selama 60 menit pada suhu 37 0C. Untuk mengakhiri inkubasi hentikan reaksi dengan menambahkan 200 μL campuran larutan TCA merkuri klorida. Sentrifugasi pada kecepatan 11500 rpm selama 5 menit pada eppendorf microcentrifuge. Setelah disentrifugasi pindahkan 400 μL larutan supernatan ke tabung lain dan tambahkan 400
μL pereaksi Ehrlich. Selanjutnya untuk blanko ditambahkan 400 μL pereaksi Ehrlich dan 400 μL aquadest. Setelah 5 menit, absorbansi diukur pada panjang gelombang 555 nm (Wigfield & Farant, 1981).
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan: tabung reaksi; hote plate, pipet ukur 1,0 ml; spektrofotometer serapan atom (Shimaddzu 650).
Bahan yang digunakan: sampel darah; larutan asam nitrat pekat; larutan asam nitrat 13%.
Cara Kerja
Sebanyak 0,5 ml darah dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan asam nitrat pekat kurang lebih 1 ml. Selanjutnya dipanaskan secara perlahan-lahan ke atas hote plate sampai tidak terjadi busa dan larutan bewarna kuning. Pemanasan dilanjutkan sampai kering dengan baik di atas hote plate. Kemudian tambahkan asam nitrat 13%. Kemudian larutan diukur dengan spektrofotometer serapan atom (AAS Simadzu AA 6200) pada panjang gelombang 283,3nm.
3.6.5. Penentuan Hematokrit
Digunakan untuk menentukan aktivitas enzim -ALAD. Alat dan Bahan
Cara Kerja
Sample darah dimasukkan ke dalam pipet hematokrit hingga hampir penuh, kedua ujung pipet ditutup dengan lilin dan kemudian disentrifuge pada kecepatan 16.000 rpm, selama 5 menit. Persentase hematokrit dibaca pada skala khusus.
3.6.6. Penentuan Kadar Hemoglobin
Kadar hemoglobin diukur dengan metode cyanmethemoglobin. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan: mikropipet, spektofotometer. Bahan yang digunakan: sampel darah, reagents untuk menentukan konsentrasi hemoglobin (Biosistem reagent & intrumen).
Cara kerja
Preparasi reagents: satu mL reagents ditambah 49 mL air suling, diaduk dan dimasukkan ke dalam botol cokelat, di simpan pada suhu 15-300C dapat stabil dalam 6 hari.
Dimasukkan darah sampel 10µL ke dalam tabung A, standard 10µL ke dalam tabung B. Pada masing-masing tabung ditambahkan reagents 25 mL. Untuk blank dimasukkan reagents 25 mL ke tabung C. Setelah itu semua tabung di vortex dan tunggu sampai 3 menit pada suhu ruangan. Setelah 3 menit tiap larutan di masukkan ke cuvets, larutan blanko di masukkan ke dalam spektrophotometer untuk dibaca nilai absorbansinya pada panjang gelombang 540nm. Kemudian dilanjutkan dengan pembacaan standard dan terakhir dilakukan pembacaan absorbansi sampel.