Sterilisasi Alat
Sterilisasi berguna untuk membersihkan alat-alat agar terhindar dari hal-hal yang dapat menimbulkan kontaminasi yang akan digunakan dalam kultur
jaringan. Semua alat seperti botol kultur, petridis, gelas ukur, erlenmeyer, cawan petri, pipet ukur, pinset, skalpel, dan alat-alat gelas lainnya terlebih dahulu direndam dalam detergen dicuci bersih dan dibilas dengan air mengalir, selanjutnya dikeringkan. Kemudian alat-alat seperti skalpel, pipet ukur, pinset dan cawan petri dibungkus dengan kertas sampul coklat, sedang untuk erlenmeyer, dan gelas ukur permukaannya ditutup dengan aluminium foil. Setelah itu, semua botol kultur dan alat-alat dimasukkan ke dalam autoklaf pada tekanan 17,5 psi, dengan suhu 1210C selama 60 menit. Kemudian alat-alat tersebut dimasukkan ke dalam oven kecuali botol kultur.
Pembuatan Media
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS dengan menggunakan dua zat pengatur tumbuh yaitu IBA dan BAP. Tahap pertama yang dilakukan adalah pembuatan larutan stok bahan kimia hara makro dengan pembesaran 20x, hara mikro dengan pembesaran 200x, larutan iron dengan pembesaran 100x, larutan vitamin dengan pembesaran 200x, sukrosa 30 g/l, myo-inositol 0,1 g/l, dan agar 7 g/l masing-masing dalam 16 tempat. Untuk pembuatan media 1 liter dilakukan dengan mengisi beker glass dengan aquades steril sebanyak 500 ml. Kemudian ditambahkan larutan stok A (makro) sebanyak 50 ml, stok B (mikro) 5 ml, stok C (iron) 10 ml, stok D (vitamin) 5 ml (lampiran 21).
Kemudian ditambahkan myo-inositol 0,1 gr/l dan sukrosa 30 gr/l. Kemudian larutan ditempatkan menjadi 1600 ml. Larutan dibagi dalam empat erlenmeyer sehingga masing-masing berisi 400 ml. Tiap erlenmeyer diberi perlakuan IBA. Keempat erlenmeyer dibagi empat sehingga diperoleh enam belas erlenmeyer, masing-masing berisi 100 ml. Tiap erlenmeyer diberi perlakuan BAP. Kemudian ditambah akuades pada tiap erlenmeyer hingga erlenmeyer berisi 250 ml. Keasaman diukur dengan pH meter. pH yang dikehendaki adalah 5,8. untuk mengatur pH yaitu menaikkan atau menurunkan pH dapat digunakan larutan NaOH atau HCl 0,1 N.
Selanjutnya, agar ditambahkan ke dalam erlenmeyer setiap perlakuan, lalu dipanaskan diatas hot plate dengan pengaduk magnetik stirer sampai larutan menjadi bening (semua agar telah larut). Media siap dipindahkan ke dalam botol kultur berdiameter 2,5 cm yang sudah diberi label sesuai dengan perlakuan sebanyak +25 ml/botol. Kemudian botol kultur tersebut ditutup dengan aluminium foil. Media dalam botol tersebut disterilisasikan di dalam autoklaf dengan tekanan 17,5 Psi, suhu 121°C selama 30 menit. Selanjutnya disimpan dalam ruang kultur sebelum digunakan.
Persiapan Ruang Kultur
Seluruh permukaan Laminar Air Flow Cabinet sebelumnya dibersihkan terlebih dahulu dan disemprot menggunakan alkohol 70 %, kemudian dilap. Lalu blower dihidupkan dan disterilkan dengan sinar Ultra Violet selama 1 jam sebelum proses penanaman dilakukan. Semua alat yang akan dipakai harus disemprot dengan alkohol 70 % sebelum dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet yang berguna untuk menghindari alat-alat penelitian terkontaminasi.
Sterilisasi Eksplan
Biji-biji kedelai direndam selama 50 menit. Biji-biji kedelai kemudian direndam 30 menit dengan deterjen sambil digojok. Setelah itu dibilas dengan air mengalir sebanyak 3 kali. Pekerjaan selanjutnya dilakukan di Laminar Air Flow (LAF) yang sudah dibersihkan/disterilkan dengan alkohol 70 %. Eksplan yang sudah bersih direndam dalam larutan fungisida Dithane M-45 2 g/l, kemudian digojok selama 30 menit. Selanjutnya dibilas dengan aquades steril minimal sebanyak 3 kali. Eksplan direndam dalam larutan Chlorox 20 % selama 10 menit sambil digojok kemudian dibilas dengan aquades steril minimal sebanyak 3 kali. Eksplan direndam dalam larutan Chlorox 10 % selama 15 menit sambil digojok kemudian dibilas dengan aquades steril minimal sebanyak 3 kali. Eksplan direndam dalam larutan Betadine 5 % selama 10 menit sambil digojok kemudian dibilas dengan aquades steril minimal sebanyak 3 kali.
Penanaman
Penanaman eksplan dilakukan di LAF yang telah disterilkan dengan alkohol 70 %. Eksplan yang akan ditanam adalah embrio dari biji kedelai. Eksplan yang akan dikulturkan ke dalam media tanam diletakkan di petridis, dimana embrio dipisahkan dari bagian endosperm secara hati-hati dengan menggunakan pinset. Kemudian eksplan ditanamkan ke dalam botol media sesuai dengan perlakuan. Setiap botol kultur terdiri dari 1 eksplan. Botol kultur diletakkan di rak kultur di bawah cahaya.
Pemeliharaan
Botol-botol kultur yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak kultur di dalam ruang kultur. Setiap hari disemprot dengan alkohol 70 % agar bebas dari
mikrooorganisme (bakteri dan jamur) yang menyebabkan terjadi kontaminasi. Suhu ruangan kultur yang digunakan 18- 22 0C dan intensitas cahaya 2000 lux.
Peubah Amatan
Persentase Pertumbuhan Eksplan (%)
Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian dengan rumus sebagai berikut:
Persentase pertumbuhan eksplan = Jumlah eksplan yang tumbuh Jumlah eksplan per perlakuan
x 100%
Persentase Pertumbuhan Kalus (%)
Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian dengan rumus sebagai berikut:
Persentase pertumbuhan kalus = Jumlah kalus yang tumbuh Jumlah eksplan per perlakuan
x 100%
Persentase Eksplan Membentuk Tunas (%)
Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian dengan menghitung jumlah eksplan membentuk tunas.
Persentase eksplan membentuk tunas = Jumlah eksplan memb. tunas Jumlah eksplan per perlakuan
x100%
Jumlah Tunas (Buah)
Jumlah tunas dihitung pada akhir penelitian dengan menghitung jumlah tunas baru yang terbentuk dari setiap eksplan.
Jumlah Daun (Helai)
Jumlah daun dihitung pada akhir penelitian dengan menghitung jumlah daun yang yang telah terbuka sempurna pada eksplan.
Panjang akar (cm)
Diukur pada akhir penelitian dengan menggunakan penggaris atau kertas milimeter mulai dari tempat munculnya akar (pangkal) sampai ujung akar.
Jumlah Akar (Buah)
Jumlah akar dihitung pada akhir penelitian dengan menghitung jumlah akar yang muncul pada eksplan.
Tinggi Plantlet (cm)
Tinggi plantlet diukur pada akhir penelitian dengan menggunakan penggaris atau kertas milimeter mulai dari pangkal batang sampai ujung daun tertinggi pada eksplan.
Visualisasi Eksplan Membentuk Embriogenesis Somatik Secara Langsung dan Tidak Langsung
Visualisasi Eksplan Membentuk Embriogenesis Somatik Secara Langsung dan Tidak Langsung dilihat pada akhir penelitian dengan melihat eksplan embriogenesis somatik secara langsung (tanpa melalui kalus) dan tidak langsung (kalus, kalus membentuk tunas, kalus membentuk akar, dan kalus membentuk tunas-akar).
