Penelitian ini diawali dengan mengeringkan Aloe vera ke dalam Freeze dryer dengan suhu -300C dan tekanan 2 atm untuk menghilangkan kadar air sehingga mencegah proses pembusukan. Proses pengeringan ini bekerja pada suhu rendah sehingga komponen yang mudah rusak atau sensitif terhadap panas dapat dipertahankan khasiatnya.10 Aloe vera yang dipergunakan sebanyak 1015,5 gram karena diperkirakan akan dapat menghasilkan ekstrak kental Aloe vera yang cukup untuk melakukan pengujian antibakteri terhadap Enterococcus faecalis. Selain itu, kapasitas Freeze dryer dapat memuat maksimal 1 kg Aloe vera dalam sekali pemakaian.
Dalam penelitian ini digunakan etanol sebagai pelarut karena bersifat tidak toksik dan telah memenuhi syarat kefarmasian atau “pharmaceutical grade”.21 Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi karena lebih sederhana dan tidak ada proses pemanasan21 sehingga mengurangi kemungkinan terjadinya penguraian zat aktif yang terkandung dalam Aloe vera.
Untuk memperoleh ekstrak kental Aloe vera, ekstrak cair diuapkan dengan rotary evaporator yang bekerja sesuai prinsip vaccum evaporator dengan menurunkan tekanan sehingga pelarut dapat menguap pada suhu di bawah titik didihnya. Dengan begitu, etanol yang seharusnya memiliki titik didih 780C dapat menguap pada suhu 400C sehingga tidak merusak senyawa-senyawa aktif yang terkandung dalam Aloe vera.
Untuk membuktikan bahwa senyawa aktif Aloe vera yang bersifat antibakteri sudah tertarik sempurna maka dilakukan uji identifikasi fitokimia terhadap ekstrak cair dari ampas terakhir Aloe vera dan ekstrak etanol Aloe vera yang diperoleh sesuai prosedur identifikasi fitokimia Farnsworth (1966).22 Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak cair dari ampas terakhir Aloe vera tidak mengandung antrakuinon, tanin dan saponin lagi sedangkan ekstrak etanol Aloe vera memiliki senyawa-senyawa antibakteri tersebut yang terlihat dari adanya reaksi bahan coba dengan pereaksi yang digunakan. Dengan demikian, terbukti bahwa senyawa aktif Aloe vera yang bersifat antibakteri seperti antrakuinon, tanin dan saponin sudah tertarik sempuna.
Ekstrak etanol Aloe vera disuspensikan dalam media Mueller Hinton Broth karena media ini memiliki pH netral yaitu 7,3 sehingga efek antibakteri yang dihasilkan murni berasal dari ekstrak Aloe vera itu sendiri, bukan karena penambahan pelarut yang bersifat asam ataupun alkali yang kemungkinan dapat meningkatkan efek antibakterinya.
Pada tahap awal, pengujian efek antibakteri dari suatu bahan dilakukan secara in vitro.Ada dua metode untuk menentukan aktifitas antibakteri, yaitu agar diffusion test dan direct exposure test (metode dilusi).23 Dalam penelitian ini dilakukan pengujian efek antibakteri dari ekstrak etanol Aloe vera terhadap Enterococcus faecalis dengan metode dilusi. Dengan metode ini bahan coba dapat berkontak langsung dengan mikroorganisme sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat dan dapat diketahui nilai MIC dan MBC dari bahan coba seperti yang direkomendasikan oleh National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, USA)24 dan sesuai dengan penelitian sebelumnya oleh Sanny pada tahun 2008 yang meneliti efek
antibakteri berbagai sediaan buah lerak terhadap Fusobacterium nucleatum (penelitian in vitro) dengan metode dilusi.24
Dalam pengujian anti bakteri, tiap konsentrasi bahan coba dilakukan replikasi sebanyak 4 kali agar diperoleh hasil yang lebih akurat dan mengetahui berapa rata- rata jumlah bakteri yang tumbuh pada ekstrak Aloe vera dalam berbagai konsentrasi karena pada konsentrasi yang sama belum tentu jumlah bakteri yang tumbuh juga sama.
Penentuan nilai MIC dilihat dari konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam yang dapat dilihat secara makroskopik dari hasil biakan pada tabung yang mulai tampak jernih dengan menggunakan metode dilusi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dari semua konsentrasi bahan coba yang diuji ternyata tidak dapat terlihat larutan yang mulai tampak jernih. Hal ini diduga akibat ekstrak etanol Aloe vera itu sendiri berwarna hijau kehitaman jadi ketika disuspensikan dengan bakteri, bahan coba berwarna hijau keruh dan setelah diinkubasi selama 24 jam, bahan coba tetap berwarna hijau keruh atau tidak mengalami perubahan dengan warna sebelumnya. Oleh karena itu, semua konsentrasi berwarna keruh dan dianggap tidak representatif untuk dicari nilai MIC. Untuk itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui nilai MIC dengan menggunakan metode yang lain.
Penentuan nilai MBC dilihat dari konsentrasi minimal bahan uji pada biakan padat (MHA) dimana tidak terlihat pertumbuhan bakteri atau seluruh bakteri mati pada media perbenihan. Dari hasil penelitian ini terlihat setelah ditanam di MHA dan diinkubasi selama 24 jam, pada konsentrasi 1,56% dan 3,125% terlihat koloni bakteri
Enterococcus faecalis tidak bisa dihitung (TBUD) karena pertumbuhan bakteri yang sangat subur sehingga koloni yang terbentuk sangat banyak. Hal ini terjadi mungkin karena kadar senyawa antibakteri dalam larutan bahan coba pada konsentrasi tersebut tidak sebanding dengan jumlah bakteri yang ada dalam suspensi bahan coba, yaitu 106 CFU/ml sehingga ketika ditanam ke media padat membentuk koloni yang sangat banyak.
Pada konsentrasi 100 %, 50%, 25% dan 12,5% tidak terlihat adanya pertumbuhan bakteri (steril) sedangkan pada konsentrasi 6,25% sudah terlihat pertumbuhan bakteri pada media perbenihan. Oleh karena itu, dapat diketahui bahwa nilai MBC adalah 12,5%. Namun, jumlah koloni bakteri pada konsentrasi 6,25% yaitu 1,58x103 CFU/ml, sangat sedikit jika dibandingkan dengan kontrol Mc Farland (264x1015CFU/ml). Jadi, ada kemungkinan MBC ekstrak Aloe vera terhadap Enterococcus faecalis berada diantara 6,25%-12,5%. Untuk itu diperlukan pengujian antibakteri dengan metode lain untuk mengetahui nilai MBC yang lebih terperinci.
Enterococcus faecalis memiliki dinding sel terdiri dari peptidoglikan, polisakarida, teichoic acid dan LTA.16,25 Tanpa peptidoglikan, bakteri tidak dapat bertahan dari perbedaan tekanan osmotik yang besar melewati membran sitoplasma sehingga sel akan lisis.25. Teichoic acid terletak diantara lapisan membran sitoplasma dan peptidoglikan yang berfungsi menjaga fungsi selubung sel dan sebagai pertahanan permeabilitas eksternal bakteri. LTA adalah teichoid acid membran yang melekat pada glikolipid membran dan mengumpul di mesosom. Membran sel Enterococcus faecalis terdiri dari fosfolipid, protein dan enzim sebagai energi.16,25
Mekanisme antibakteri yang ditimbulkan ekstrak etanol Aloe vera terhadap Enterococcus faecalis kemungkinan berasal dari senyawa aktif yang dikandungnya sepeti antrakuinon, tanin dan saponin.7,8,17 Antrakuinonmemiliki gugus quinon yang diduga dapat membentuk kompleks yang bersifat ireversibel dengan asam amino nukleofilik dalam protein yang menyebabkan protein menjadi tidak aktif dan kehilangan fungsi.Protein sasaran dari senyawa tersebut adalah adhesin yang terdapat pada permukaan sel, polipeptida pada dinding sel dan enzim yang terikat pada membran sel. Tanin merupakan senyawa golongon fenolik, memiliki molekul yang diduga dapat membentuk kompleks dengan protein sehingga mampu menginaktivasi adhesin bakteri, enzim, dan protein transport cell envelope.19
Saponin bekerja sebagai sabun/deterjen yang membuat senyawa ini terkonsentrasi pada permukaan sel.10,20 Ujung hidrofobik deterjen akan berikatan dengan ujung hidrofobik protein dengan menggeser sebagian besar ujung lipid yang terikat. Ujung polar deterjen merupakan suatu ujung bebas sehinggga membawa protein ke dalam larutan sebagai suatu kompleks deterjen-protein, yang biasanya juga mengandung beberapa lipid residual. Sifat ini menyebabkan senyawa ini mampu melarutkan protein membran.20 Uji coba efek antibakteri terhadap Enterococcus faecalis menggunakan keseluruhan ekstrak etanol Aloe vera tanpa memisah-misah senyawa mana yang terkandung di dalamnya sehingga tidak diketahui zat aktif mana yang memiliki efek antibakteri paling besar pada Aloe vera.
Enterococcus faecalis merupakan bakteri yang bisa bertahan dalam saluran akar walaupun nutrisi terbatas, adanya toksin dari bakteri lain dan invasi dari medikamen saluran akar. Dalam kondisi dibawah tekanan seperti ini, terjadi
perubahan fisiologi yang spesifik yaitu suatu respon yang bertindak sebagai mekanisme pertahanan dari tekanan lingkungan. Pada kondisi ini terjadi fase Viable but Nonculturable (VBNC) yaitu bakteri kehilangan kemampuan untuk tumbuh dan berkembang tetapi tetap hidup dan bersifat patogen. Pada fase ini komposisi petidoglikan meningkat dan kuantitas teichoid acid dan LTA menjadi 2 kali lipat sehingga dinding sel lebih kuat dan lebih tahan terhadap tekanan mekanis sehingga Enterococcus faecalis merupakan bakteri yang persisten dalam infeksi saluran akar.26
Ada perbedaan hasil penelitian efek antibakteri Aloe vera terhadap beberapa jenis bakteri. Bakteri yang diuji peneliti adalah Enterococcus faecalis sedangkan peneliti sebelumnya meneliti Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans dan Candida albicans. Morfologi bakteri yang berbeda menyebabkan struktur dinding sel bakteri juga berbeda sehingga diduga menyebabkan perbedaan aktifitas dan besar konsentrasi bahan coba dalam membunuh sel bakteri tersebut. Spesifikasi dinding sel bakteri yang diuji terlihat pada tabel 3.
Tabel 3. PERBEDAAN DINDING SEL BAKTERI12,13,16,25
Nama bakteri E.faecalis S.mutans F.nucleatum C.albicans
Dinding sel - Peptidoglikan - polisakarida - Teichoic Acid - LTA - Peptidoglikan - Polisakarida - Protein - LTA Membran luar : Lipopolisakarida, Lipoprotein, Protein(30%), Posfolipid Ruang Periplasmik Peptidoglikan Membran dalam: Posfolipid, Protein - Glukan - Mannan - Kitin - Protein (6 % - 25 %) - Lipid (1 % - 7 %)
Penelitian sebelumnya menunjukkan efek antibakteri ekstrak etanol Aloe vera terhadap Fusobacterium nucleatum memiliki MBC 50% sangat berbeda dengan hasil
penelitian yang dilakukan terhadap Enterococcus faecalis yaitu dengan MBC 12,5%. Hal ini diduga karena Fusobakterium nucleatum adalah golongan bakteri gram negatif sedangkan Enterococcus faecalis merupakan bakteri gram positif. Bakteri gram negatif memiliki lapisan-lapisan dinding sel yang lebih kompleks dibandingkan bakteri gram positif (gambar 20) sehingga senyawa antibakteri Aloe vera lebih sulit berdifusi ke dalam membran sel bakteri gram negatif.
Gambar 20. Perbandingan dinding sel bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. (A) Bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal yang mengandung teichoic acid dan LTA, (B) Bakteri gram negatif memilki lapisan peptidoglikan yang tipis dan membran luar yang mengandung lipopolisakarida, fosfolipid dan protein. Ruang periplasmik antara membran sitoplasma dan membran luar mengandung transport, degradasi dan sintesis protein dinding sel. Membran luar bergabung dengan membran sitoplasma di titik perlekatan dan diikat peptidoglikan melalui jembatan lipoprotein. 26
Selain karena morfologi bakteri yang berbeda, perbedaan metode dan sediaan bahan coba juga diduga sebagai penyebab berbedanya konsentrasi minimal bahan coba yang dapat menghambat ataupun membunuh bakteri. Penelitian sebelumnya
membuktikan bahwa powder dan ekstrak etanol Aloe vera memiliki daya antibakteri terhadap Fusobacterium nucleatum dengan nilai MBC 20% dan 50% dan memiliki efek antifungal terhadap Candida albicans dengan nilai MIC 2,5% dan 21%.10 besar konsentrasi yang diperoleh peneliti berbeda dengan peneliti sebelumnya mungkin karena dalam pelaksanaan metode ekstraksi, peneliti melakukan remaserasi ampas Aloe vera agar zat antibakteri Aloe vera tertarik sempurna sedangkan peneliti sebelumnya hanya melakukan sekali maserasi saja.
Penelitian lain menunjukkan bahwa perasan daun Aloe vera memiliki efek antibakteri pada streptococcus mutans pada konsentrasi 25% (Trelia B, 2002).12 Perbedaan hasil penelitian kemungkinan karena peneliti sebelumnya hanya menggunakan perasan daun saja tetapi tidak menggunakan metode ekstraksi seperti yang peneliti lakukan sehingga diduga zat-zat antibakteri dalam Aloe vera pada peneliti sebelumnya tidak tertarik secara sempurna.
Penelitian lain juga menunjukkan gel Aloe vera memiliki efek antibakteri dengan konsentrasi diatas 70% (Zimmerman, 1969 cit Kathuria dkk, 2011).11 Lebih besarnya konsentrasi yang diperoleh dibandingkan penelitian ini karena adanya perbedaan sediaan bahan coba yang digunakan dimana hanya menggunakan gel Aloe vera saja sedangkan dalam penelitian ini digunakan keseluruhan daun Aloe vera, baik gel maupun kulit daun. Zat antibakteri yang terdapat dalam gel hanyalah saponin dan tanin sedangkan jika yang digunakan adalah keseluruhan daun maka terdapat zat antibakteri berupa antrakuinon, saponin dan tanin.10 Oleh karena itu, pada penelitian ini Aloe vera sudah dapat membunuh bakteri dengan konsentrasi yang lebih kecil dibandingkan penelitian terdahulu.
