BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESA PENELITIAN
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Aloe vera
Aloe vera dicuci lalu ditimbang sebanyak 1015,5 gram dengan electronic balance kemudian diiris tipis + 2 mm disusun dalam cawan (gambar 5) dan dikeringkan dengan freeze dryer modulyo sehingga diperoleh 28,2 gram Aloe vera kering (gambar 6). Kemudian Aloe vera kering diblender sehingga diperoleh serbuk Aloe vera (gambar 7). Selanjutnya serbuk Aloe vera dimasukkan kedalam erlemenyer dan ditambahkan etanol 96% sebanyak 600 ml dan dimaserasi selama 2 hari sambil digoncang-goncangkan sekali dalam sehari (gambar 8). Setelah 2 hari lalu disaring dengan menggunakan kertas saring dan diperoleh ekstrak cair sebanyak 380 ml. Ampas Aloe vera dimaserasi kembali (remaserasi) selama 2 hari dengan menambahkan etanol sebanyak 350 ml (gambar 9) dan diperoleh 250 ml ekstrak cair Aloe vera. Prosedur remaserasi ini dilakukan sebanyak dua kali (total lamanya maserasi selama 6 hari). Setiap ekstrak cair yang diperoleh diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator (gambar 10) sehingga didapatkan ekstrak kental Aloe vera. Seluruh ekstrak kental Aloe vera yang diperoleh seberat 6,6 gram dan disimpan dalam botol kaca tertutup.
Gambar 5. Aloe vera ditimbang, diiris tipis lalu disusun dalam cawan.
Gambar 7. Aloe vera kering diblender sehingga diperoleh serbuk Aloe vera
Gambar 8. Aloe vera dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan etanol dan dimaserasi selama dua hari sambil digoncang-goncangkan.
Gambar 10. Ekstrak cair Aloe vera diuapkan dengan rotary evaporator
4.7.2 Uji Identifikasi Fitokimia
Untuk mengetahui bahwa zat-zat aktif Aloe vera yang bersifat antibakteri telah tertarik secara sempurna selama proses ekstraksi maka dilakukan uji identifikasi fitokimia terhadap ekstrak etanol Aloe vera yang diperoleh dan ekstrak cair dari ampas terakhir Aloe vera yang telah dimaserasi dengan etanol 96% selama 1 hari (gambar 11) dan kemudian dibandingkan reaksinya terhadap zat-zat pereaksi yang digunakan.
Gambar 11. (a) ekstrak etanol Aloe vera, (b) ekstrak cair dari ampas terakhir Aloe vera yang dimaserasi selama 1 hari dengan etanol 96%.
4.7.2.1 Uji Antrakuinon
Masukkan 2 tetes ekstrak etanol Aloe vera ke dalam tabung reaksi dan tambahkan 2,5 ml asam sulfat 2N lalu dipanaskan sebentar. Setelah dingin ditambahkan 5 ml benzen kemudian dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzen dengan 1 ml NaOH 2N. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakuinon. Prosedur yang sama dilakukan pada ekstrak cair dari ampas terakhir Aloe vera.
4.7.2.2 Uji Saponin
Masukkan 5 tetes ekstrak etanol Aloe vera ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml air panas lalu didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuknya busa yang stabil selama 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl 2N menunjukkan adanya saponin. Prosedur yang sama dilakukan pada ekstrak cair dari ampas terakhir Aloe vera.
4.7.2.3 Uji Tanin
Masukkan 5 tetes ekstrak etanol Aloe vera kedalam tabung reaksi, dicairkan dengan penambahan 5 tetes aquades dan didihkan selama 3 menit dalam 100 ml air lalu disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes pereaksi FeCl3 1 %. Jika terdapat
endapan hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin. Prosedur yang sama dilakukan pada ekstrak cair dari ampas terakhir Aloe vera.
4.7.3 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak Etanol Aloe vera yang diuji dimulai pada konsentrasi terbesar (100%) karena belum diketahui konsentrasi ekstrak etanol Aloe vera yang mampu menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis. Ekstrak etanol Aloe vera disuspensikan dengan media Mueller Hinton Broth (MHB) dengan perbandingan 1gram/1ml. Setelah itu, dilakukan pengenceran berganda dengan cara mengambil setengah dari ekstrak etanol Aloe vera konsentrasi 100% lalu ditambahkan 0,5 ml MHB untuk mendapatkan konsentrasi 50% kemudian mengambil setengah dari ekstrak etanol Aloe vera konsentrasi 50% lalu ditambahkan 0,5 ml MHB untuk mendapatkan konsentrasi 25% dan begitu seterusnya hingga diperoleh konsentrasi 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,56% (gambar 12).
Gambar 12. Ekstrak etanol Aloe vera yang disuspensikan dengan Mueller Hinton Broth
4.7.4 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media MHA. Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam petri (20 ml/petri) lalu media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 1210 C. Kemudian media dimasukkan kedalam inkubator selama 24 jam
untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak. Jika media steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan spesimen.
4.7.5 Pembiakan Spesimen
Enterococcus faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil beberapa koloni dengan jarum ose steril lalu disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 10 ml larutan NaCl 0,9% sampai didapat kekeruhan suspensi bakteri yang sama dengan kekeruhan standar 0,5 Mc Farland, ini berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 108 CFU/ml. Penyetaraan kekeruhan ini dilakukan dengan bantuan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm dan absorbansi 0,156. Setelah itu dilakukan pengenceran dengan mengambil 0,1 ml biakan bakteri (108 CFU/ml), dimasukkan kedalam tabung steril yang berisi larutan NaCl 0,9% sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen. Maka diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi 106 CFU/ml yang akan digunakan pada pengujian aktivitas antibakteri.
4.7.5 Penentuan MIC Bahan Coba
Konsentrasi ekstrak etanol Aloe vera yang diuji dalam penelitian ini adalah 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,56%. Dari masing-masing konsentrasi ekstrak etanol dari pengenceran berganda yang telah dilakukan, ambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam pada
inkubator CO2. Kemudian amati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan
tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai MIC. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih merupakan MIC bahan uji.
4.7.6 Penentuan MBC Bahan Coba
Dari hasil prosedur penentuan nilai MIC dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra yaitu ekstrak etanol Aloe vera 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,56%. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan MIC, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas divorteks dan diambil 50 µl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat (Mueller Hinton Agar), dilakukan 4 replikasi, diamkan selama 15-20 menit. Setelah mengering diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 370 C selama 24
jam.
Kemudian jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dibuat rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil
perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar (CFU/ml).
