Isolasi DNA genom jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) menggunakan metode Doyle&Doyle (1987) yang dimodifikasi. Cetil trimetil ammonium bromida (CTAB) yang digunakan dalam ekstraksi DNA ini berfungsi untuk mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman. CTAB bersifat sebagai detergen kationik akan membentuk kompleks tak larut dengan asam nukleat sehingga dapat memisahkan kontaminan polisakarida dan polifenol dari asam nukleat serta dapat menghambat aktivitas nuklease. Metode Doyle&Doyle (1987) yang dimodifikasinya adalah penambahan natrium disulfit pada buffer CTAB.
Ekstraksi DNA pada penelitian ini menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan
penghangatan pada suhu 65°C (Subandiyah 2006). Isopropanol merupakan
alternatif dari etanol absolut. Isopropanol lebih efisien dalam persipitasi DNA dibandingkan etanol. Namun, isopropanol kurang volatil sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mengeringkan pellet (Sambrook et al. 2001).
Berbagai metode telah dilakukan sebelumnya untuk mendapatkan kualitas DNA yang diinginkan agar dapat memenuhi persyaratan untuk pustaka genom dan metode ini yang tepat untuk menghasilkan kualitas DNA yang mengandung
double stranded DNA dengan konsentrasi yang tinggi. Banyak faktor yang mempengaruhi keberhasilan isolasi DNA untuk menghasilkan kualitas dengan konsentrasi double stranded DNA yang tinggi, salah satunya adalah tanaman yang digunakan berumur tidak terlalu tua (masih muda) dan dalam keadaan yang segar. Protokol Doyle & Doyle (1987) sering digunakan untuk ekstraksi DNA tanaman (Ribeiro et al. 2007).
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
Hasil isolasi DNA divisualisasikan melalui elektroforegram yang sebelumnya dilakukan elektroforesis terlebih dahulu (Gambar 1). Uji kualitatif yang divisualisasikan melalui elektroforegram menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang
17 ukurannya memiliki rentang beberapa ratus hingga sekitar 20000 kb. Konsentrasi gel yang sangat encer (0.1-0.2%) dapat meningkatkan daya pisah elektroforesis tetapi hal tersebut sulit dilakukan karena gel yang encer sangat mudah pecah. Pada konsentrasi 1% bobot per volume, gel yang berada dalam buffer yang mengandung air dalam kadar tinggi menghasilkan struktur serat yang baik dengan ukuran pori besar dan tahan terhadap gesekan. Agarosa bersifat tidak toksik, kompleks berupa bubuk yang terdiri dari campuran polimer dengan dua unit dasar galaktosa, agarosa dan agaropektin (Bintang 2010).
Hasil isolasi DNA genom jagung dari empat genotipe jagung menunjukkan hasil yang baik, terlihat dari intensitas pita DNA yang jelas. Terlihat intensitas terdapat pada dasar elektroforegram empat genotipe. Intensitas tersebut merupakan konsentrasi RNA. Hal ini dapat disebabkan karena penggunaan RNAse yang terlalu sedikit sehingga masih terdapat RNA (Gambar 2). Hasil elektroforesis juga menunjukkan bahwa keempat pita DNA yang dihasilkan merupakan DNA genom, karena ukuran pita DNA yang cukup besar (lebih dari 1500 bp). Sesuai dengan pernyataan Brown (2007) bahwa elektroforesis gel akan memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukurannya, semakin besar molekul DNA maka pita DNA yang dihasilkan semakin dekat dengan sumur gel.
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
Selain diuji secara kualitatif, DNA hasil isolasi juga diuji secara kuantitatif. Uji kuantitatif ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi DNA dan tingkat kemurnian DNA dari kontaminan polisakarida, dan protein. Uji kuantitatif dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm. Panjang gelombang 230 nm merupakan serapan maksimum untuk polisakarida, panjang gelombang 260 nm merupakan serapan maksimum untuk asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm merupakan serapan maksimum untuk protein. Kemurnian DNA ditentukan melalui rasio A260/A280 dan A260/A230. Rasio A260/A280 menunjukkan kemurnian DNA terhadap protein, sedangkan rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA terhadap polisakarida. Hasil uji kuantitatif genom total DNA jagung yang dihasilkan memiliki kisaran 745.10 – 2547.20 ng/µ L dengan rasio A260/A280 berkisar antara 1.97 - 2.03 ng/µ L dan rasio A260/A280 berkisar antara 2.03 – 2.17 ng/µ L (Tabel 1). Menurut Walker&Wilson (2000), nilai kemurnian yang lebih dari 2.00 menujukkan adanya kontaminasi RNA, sedangkan nilai kemurnian yang kurang dari 1.80 menunjukkan sampel terkontaminasi polisakarida dan protein (Yuwono 2005). Hal ini menunjukkan hasil isolasi DNA tergolong baik meskipun ada kontaminasi RNA karena rasio lebih dari 2.00.
Uji kuantitatif juga dilakukan dengan menggunakan Qubit 2.0 fluorometer. Uji kuantitatif ini berbeda dengan uji kuantitatif sebelumnya yang menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific, karena Qubit 2.0 fluorometer hanya menghitung konsentrasi double stranded DNA (dsDNA). Double stranded DNA (dsDNA) ini dijadikan tolak ukur untuk ke tahapan selanjutnya yaitu pustaka genom yang mempunyai persyaratan bernilai 20 ng/µ L. Qubit 2.0 fluorometer
memiliki nilai ketelitian yang tinggi sehingga mampu mendeteksi konsentrasi yang sangat rendah (Invitrogen 2010). Kosentrasi double stranded DNA berkisar antara 55.60 – 112.00 ng/µ L. Berdasarkan uji kualitatif dan kuantitatif, DNA genom jagung yang telah diisolasi berhasil memenuhi persyaratan untuk
18
digunakan sebagai bahan konstruksi pustaka genom. DNA genom yang dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus memiliki kualitas dan kuantitas yang baik. DNA genom yang digunakan harus utuh dan memiliki konsentrasi yang tinggi (Michiels et al. 2003).
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
Konsentrasi double stranded DNA yang didapat dari pengukuran dengan menggunakan Qubit 2.0 fluorometer diencerkan dengan buffer resuspensi untuk difragmentasi menggunakan covaris M220. Buffer resuspensi ini digunakan untuk menjaga DNA agar selalu dalam kondisi yang baik dan stabil serta untuk melarutkan kembali DNA. Sampel DNA dicairkan sampai volume 55 µL dengan konsentrasi 20 ng/µL. Volume DNA yang akan diencerkan didapatkan dengan cara konsentrasi minimal pustaka genom yaitu 20 ng/µ L dikalikan dengan volume 55 µL dibagi dengan konsentrasi DNA double stranded dengan satuan ng/µL sehingga didapat konsentrasi double stranded DNA yang diencerkan berkisar antara 9.82 – 19.78 µL (Tabel 3). Semakin besar konsentrasi double stranded
DNA, maka semakin sedikit buffer resuspensi yang digunakan untuk mengencerkan (Covaris 2012).
Kualitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
Fragmentasi DNA genom merupakan tahapan pertama dalam konstruksi pustaka genom. Pustaka genom merupakan kumpulan sekuens (urutan) DNA dari suatu organisme. Bagian-bagian spesifik dari genom kemudian dapat disub-klon untuk memperoleh pustaka sub-genom (Wulandari 2009). Pustaka genom merupakan bagian yang sangat penting dalam program perbaikan genetika tanaman secara molekuler maupun melalui pemuliaan konvensional karena sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan karakterisasi suatu gen dan dapat digunakan untuk pemetaan gen secara fisik (Suharsono 2003). Pustaka genom menggunakan DNA genomik atau kromosom sebagai sumber DNA yang digunakannya. Hal yang perlu diperhatikan ketika melakukan konstruksi suatu perpustakaan gen adalah perpustakaan tersebut harus merepresentasikan semua gen yang ada di dalam sumber DNA asalnya. Perpustakaan gen dikatakan representatif apabila berisi semua sekuens aslinya. Perpustakaan genom yang representatif dapat dibuat dengan cara memurnikan DNA genomik, kemudian dipotong secara acak menjadi fragmen-fragmen yang ukurannya sesuai dengan keperluan kloning menggunakan vektor yang dipilih. Pemurnian DNA genomik eukariot biasanya dilakukan dengan terlebih dahulu mengisolasi nukleus dan menghilangkan protein, lemak, serta makromolekul lain yang tidak diinginkan dengan memberikan protease dan melakukan ekstraksi fenol-kloroform. Sementara itu, DNA prokariot dapat diekstraksi langsung (Wahyudi 2001).
Menurut Wahyudi (2001), DNA genomik hasil pemurnian tersebut selanjutnya dipotong-potong secara acak. Pada dasarnya ada dua cara pemotongan, yaitu pemotongan fisik seperti sonikasi dan digesti menggunakan enzim restriksi. Fragmentasi yang dilakukan dalam penelitian ini dengan cara sonikasi dengan memotong DNA genom secara acak pada kisaran pemotongan 300-400 bp. Fragmentasi dengan teknik sonikasi ini menggunakan insrumen
covaris M220. Covaris M220 ini memiliki fokus ultrasonikator dengan proses AFA (adaptive focused acoustic) yang memiliki kekuatan memotong DNA secara
19 hidrodinamik menjadi potongan acak. Proses ini berlangsung dalam keadaan
isothermal untuk memastikan kedua fragmen dalam potongan yang sama dan memiliki konsentrasi double stranded DNA yang tinggi (Covaris 2012).
Konstruksi pustaka genom jagung pada penelitian ini mengikuti protokol
TruSeq DNA low troughput protocol dari Illumina yang dimodifikasi pada beberapa tahapannya. Tujuan dari protokol ini yaitu menambahkan sekuen adaptor ke dalam ujung fragmen DNA untuk menghasilkan pembacaan ganda atau sekuen ujung pasangan pustaka. Tahapan awal konstruksi pustaka genom jagung ini adalah isolasi DNA genom utuh dari jagung , kemudian dilakukan pemotongan DNA pada panjang tertentu yang diharapkan potongan tersebut telah dapat mewakilkan gen-gen penyandi genom jagung, modifikasi ujung DNA, adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor. Hasil konstruksi dari pustaka genom nantinya dapat dianalisis agar dapat dilanjutkan ke tahap berikutnya (Illumina 2010c).
Selanjutnya hasil fragmentasi dengan covaris M220 diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA mengalami penurunan dari kisaran 55.60 – 112.00 (ng/µ L) (hasil isolasi DNA genom) menjadi kisaran 13.00 – 19.10 ng/µ L (setelah dilakukan fragmentasi) (Tabel 4). Hasil konsentrasi DNA yang mengalami penurunan tersebut menunjukkan bahwa DNA sudah terpotong-potong. Rasio A260/A280 berkisar antara 1.85 – 2.15 menunjukkan DNA masih memiliki kemurnian yang baik karena rasio A260/A280 masih berada dalam kisaran 1.8 – 2.0 (Walker & Wilson 2000).
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End Repair)
Modifikasi ujung fragmen DNA merupakan tahapan kedua setelah fragmentasi dalam konstruksi pustaka genom. Modifikasi ujung fragmen DNA atau end repair memiliki tujuan untuk mengubah ujung lengket pada fragmen DNA menjadi ujung tumpul (blunt end). Tahapan end repair ditambahkan end repair mix yang mengandung enzim eksonuklease dan enzim polymerase. Kerja kedua enzim ini bergantung pada letak ujung lengket. Jika ujung lengket terletak pada 3’OH dari fragmen DNA, maka enzim eksonuklease akan memotong ujung lengket tersebut. Tapi jika ujung lengket terletak pada ujung 5’P dari fragmen DNA maka enzim polimerase akan membentuk utas DNA baru yang bersifat komplemen dengan utas DNA pada ujung lengket (Illumina 2010a).
Fragmen DNA yang telah mengalami modifikasi dipurifikasi menggunakan Sample Purification Beads. Purifikasi menggunakan Sample Purification Beads juga dilakukan pada tahapan adenilasi ujung 3’OH dan ligasi.
Sample Purification Beads efektif dalam mengikat fragmen DNA dan menghilangkan kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan selama preparasi konstruksi pustaka genom karena terdapat manik-manik paramagnetik. Magnetic stand yang membantu kerja Sample Purification Beads dalam mengikat DNA yang akan menempel pada dinding tabung saat inkubasi dan memisahkannya dari pereaksi yang masih terlarut. Inkubasi ini dilakukan untuk mengoptimalkan penempelan fragmen DNA pada dinding tabung yang tertarik oleh manik-manik paramagnetic sehingga larutan menjadi jernih. Pencucian dengan etanol 80% bertujuan untuk menghilangkan pereaksi-pereaksi yang masih tersisa setelah tahap inkubasi, sedangkan buffer resuspensi ditambahkan untuk melarutkan
fragmen-20
fragmen DNA yang masih menempel pada dinding tabung (Agencourt Bioscience Corp 2009).
Hasil modifikasi ujung fragmen atau end repair diuji secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA pada tahapan fragmentasi berkisar antara 13.00 – 19.10 ng/µ L dan pada tahapan
end repair mengalami peningkatan dengan kisaran 562 – 590 ng/µ L (Tabel 5). Peningkatan konsentrasi DNA ini dapat disebabkan karena penambahan Sample Purification Beads sebanyak 2x. Pertama berupa dilute beads mix yang merupakan campuran antara Sample Purification Beads dengan buffer resuspensi dan kedua dengan Sample Purification Beads. Agencourt Bioscience Corp (2009) menyatakan bahwa Sample Purification Beads berfungsi untuk mengikat DNA sehingga banyak DNA yang terjerap oleh manik-manik paramagnetik dan pada akhir tahapan end repair hanya dilarutkan dengan 17.5 µL buffer resuspensi. Berbeda pada tahapan fragmentasi sebanyak 55 µL sehingga konsentrasi larutan menjadi pekat. Hal ini yang dapat menyebabkan konsentrasi DNA meningkat pada tahapan modifikasi ujung fragmen atau end repair. Rasio A260/A280 pada tahapan end repair berkisar antara 2.19 – 2.39. Nilai Rasio A260/A280 masih tergolong baik meskipun nilainya di atas 2, namun tidak terlalu besar nilai selisihnya (Walker & Wilson 2000).
Kuantitas Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter DNA Genom Jagung
Tahapan adenilasi ujung 3’OH dan ligase adapter, kedua ujung 3’OH pada fragmen DNA berikatan dengan basa tunggal adenin. Tujuan dari tahapan ini adalah mencegah ligasi antar fragmen DNA dan mempersiapkan fragmen DNA sebelum dilakukan ligasi adapter. Basa tunggal timin pada ujung adapter berikatan dengan basa adenin pada ujung fragmen DNA. Ligasi adapter pada preparasi konstruksi pustaka genom bertujuan untuk membantu pengikatan pustaka genom pada flow cell saat tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2010b). Tahap adenilasi menggunakan a tailing mix bertujuan untuk membuat fragmen DNA menjadi kompatibel dengan adaptor dan mencegah ligasi sendiri (self ligation) dengan penambahan adenin tersebut pada 3’. Tahap adenilasi juga didukung dengan pengoptimasian inkubasi menggunakan thermocycle dengan suhu dan waktu yang telah ditentukan dalam TruSeq DNA low troughput protocol dari Illumina (Illumina 2010c).
Indeks adaptor juga ditambahkan dengan tujuan sebagai indeks atau adaptor penunjuk pada ujung fragmen DNA dan menyiapkan pengikatan pustaka untuk hibridisasi pada flow cell. Salah satu contoh indeks adaptor yang digunakan adalah indeks adaptor nomor 2 (AD002) yang berisi sekuen nukleotida CGATGT (A) serta ligation mix ditambahkan dengan tujuan menghubungkan adaptor untuk disisipkan (Illumina 2010c). Proses ligasi dihentikan dengan menambahkan stop ligation buffer. Stop ligation buffer segera ditambahkan karena proses ligasi yang masih aktif menyebabkan adanya interaksi antar nukleotida bahkan mengakibatkan adaptor saling menempel satu sama lain sehingga tidak menghasilkan pustaka dengan kualitas yang baik yang akan berpengaruh pada hasil sekuensing. Uji kuantitatif dilakukan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Terjadi penurunan konsentrasi pada tahap ligasi.
21 Kualitas Pustaka Genom Jagung
Setelah konstruksi pustaka genom dilakukan, langkah selanjutnya adalah pengujian hasil pustaka secara kuantitatif menggunakan quantitative PCR (qPCR), sedangkan secara kualitatif menggunakan agilent bioanalyzer. qPCR memiliki fungsi yang berbeda dengan agilent bioanalyzer, yaitu qPCR memiliki akurasi yang lebih baik dibandingkan agilent bioanalyzer, karena qPCR hanya menghitung pustaka yang memiliki fragmen dengan ditempeli adaptor pada kedua ujungnya dan menggunakan dua primer sehingga konsentrasi atau molaritas yang dihasilkan lebih sedikit. Berbeda dengan qPCR, agilent bioanalyzer mengukur semua hasil pustaka berdasarkan potongannya meskipun fragmen hanya ditempeli adaptor pada salah satu ujungnya sehingga konsentrasi atau molaritas yang dihasilkan jauh lebih besar dibandingkan dengan qPCR (Sigma 2008).
Prinsip pengujian elektroforesis yang didasarkan pada prinsip gel elektroforesis yang dipindahkan ke dalam bentuk chip atau lempengan. Bentuk lempengan akan mengurangi penggunaan waktu dan penggunaan sampel. Untuk pengujian kuantitas DNA dan protein dapat diselesaikan dengan bantuan “upper marker”. Peak sampel berada dibawah daerah upper marker dan karena konsentrasi upper marker telah diketahui maka konsentrasi tiap sampel juga dapat dihitung (Agilent Technologies 2003). Berdasarkan (Tabel 7) yang didapat dari
agilent bioanalyzer, ukuran fragmen DNA hasil pustaka berada pada kisaran 638 dan 970 bp. Kualitas pustaka yang baik memiliki ukuran fragmen <800 bp. Genotipe PSG59-8 (genjah) memiliki ukuran fragmen >800 bp namun memiliki konsentrasi yang paling tinggi sebesar 10.80 (nmol/L). Meskipun genotipe PSG59-8 (genjah) kurang memenuhi persyaratan, namun klasterisasi dan sekuensing tetap dilakukan untuk melihat hasilnya.
Penghitungan ukuran basa juga dilakukan menggunakan elektroforesis 2 %. Sampel yang digunakan merupakan hasil dari qPCR. Genotipe yang diuji menggunakan elektroforesis yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B dan LBP54-50 (pulut). Kedua genotipe ini memiliki ukuran basa yang sama setelah dianalisis menggunakan software bioinformatika yaitu photocap molecule weight, yaitu bernilai 658 bp (Gambar 3). Kekurangan dari teknik menggunakan elektroforesis dan dianalisis menggunakan software bioinformatika photocap adalah hasil yang didapat kurang akurat dibandingkan dengan agilent bioanalyzer.
Kuantitas Pustaka Genom Jagung
Terdapat tiga faktor pengenceran yang berbeda, yaitu 1000, 2000 dan 4000. Tiap genotipe jagung ((Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) dilakukan secara duplo atau triplo bertujuan untuk menghindari pada saat pembacaan di instrumen qPCR. Konsentrasi pustaka genom kentang yang dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu minimal 2 nM yang diencerkan ke dalam Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1% Tween 20 untuk mencegah absorbsi template ke tabung saat siklus karena dapat menurunkan jumlah klasterisasi. Genotipe PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) memenuhi persyaratan minimal konsentrasi untuk sekuensing, edangkan untuk genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B dan LK2-45 memiliki konsentrasi <2 nM, namun klasterisasi dan sekuensing tetap dilakukan, karena konsentrasi paling minimal digunakan yaitu 0.6 nM, 2 nM merupakan syarat yang paling baik untuk dilakukan ke proses selanjutnya yaitu klasterisasi dan sekuensing (Lampiran 2). Proses klasterisasi
22
sendiri menggunakan pustaka DNA genom dengan konsentrasi 8 pM dan 13 pM, hasil ini bisa diperoleh dari pengenceran stok pustaka DNA 2 nM.
Klasterisasi dan Hasil Sekuensing Genom Total DNA Jagung
Konstruksi pustaka genom yang telah dilakukan serta diuji hasilnya secara kuantitatif dengan qPCR dan agilent bioanalyzer, kemudian diklasterisasi menggunakan cBot Cluster Generation. Klasterisasi pustaka genom terdiri dari lima tahapan, yaitu denaturasi, immobilisasi dan perpanjangan DNA, amplifikasi, linearisasi dan hibridisasi (Lampiran 3). Klasterisasi ini bertujuan untuk menghasilkan klaster atau kelompok salinan dari pustaka genom yang akan disekuen (Mardis 2008).
Sekuensing genom total menggunakan Next Generation Sequencing
(NGS) memiliki beberapa kelebihan, diantaranya memiliki akurasi yang tinggi yaitu 99% dan biaya yang dibutuhkan juga lebih murah dibandingkan dengan metode Sanger. Instrumen NGS yang digunakan pada penelitian ini salah satunya adalah HiSeq2000 (Lampiran 5). Kelebihan Hiseq2000 yaitu mampu mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30 kali cakupan secara bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen. instrument ini juga menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp selama kurang lebih 11 hari. Terdapat empat tahapan secara umum dalam sekuensing DNA menggunakan HiSeq2000, yaitu preparasi sampel pustaka genom, klasterisasi pustaka genom, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina 2010a).
Prinsip sekuensing menggunakan NGS HiSeq2000 adalah Sequencing by Synthesis (SBS) (Lampiran 6). Selama proses sekuensing berlangsung, keempat basa nitrogen penyusun DNA (adenin, timin, guanin dan sitosin) dialirkan secara simultan ke dalam flow cell (Lampiran 7). Kemudian akan berikatan dengan fragmen DNA polymerase. Secara spesifik, keempat basa tersebut membawa penanda berupa fluorescen yang akan berpendar ketika basa-basa tersebut berikatan membentuk utas DNA yang komplemen dengan fragmen DNA pada klaster. Gugus 3’OH pada basa-basa tersebut mengalami modifikasi sehingga tidak dapat berikatan dengan basa penyusunnya yang lain sebelum satu siklus sintesis telah selesai dilakukan. Satu siklus telah selesai jika pendaran fluorescen yang dihasilkan dari basa yang telah disintesis dideteksi oleh kamera CCD. Kamera CCD ini akan menangkap pendaran fluorescen hasil reaksi pembentukan utas DNA dan akan menampilkan hasilnya melalui tampilan Real Time Analysis
pada monitor NGS HiSeq2000. Berakhirnya satu siklus ditandai dengan putusnya ikatan kimia penanda fluorescen dan gugus 3’OH termdifikasi yang selama sintesis berikatan dengan fragmen DNA dalam klaster (Mardis 2008, Ansorge 2009, Metzker 2010).
Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum
Jumlah basa hasil sekuensing empat genotipe jagung ((Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) secara total diperoleh sebanyak 287.1 Gbp (Tabel 8). Hasil ini memiliki kesamaan dengan jumlah basa pada projected total yield. Projected total yield merupakan jumlah basa yang diprediksikan selama proses sekuensing berlangsung serta hasil ini bergantung pada tipe pembacaan basa yang dipilih selama proses sekuensing. NGS HiSeq2000 memiliki empat tipe pembacaan yaitu single read, paired end,
23
multiplexed single read dan multiplexed paired end. Pada penelitian ini dilakukan tipe pembacaan paired read dengan pembacaan sebanyak 200 siklus (Illumina 2010a). Yield perfect yang diperoleh selama proses sekuensing sebesar 5.1 Gbp (Tabel 8). Nilai yield perfect menunjukan jumlah basa yang secara akurat melewati passing filter. Passing filter merupakan sejenis algoritma yang dipakai oleh komputer untuk menentukan kearutan pembacaan basa saat sekuensing.
Tingkat kesalahan selama proses sekuensing berlangsung dapat dilihat dari
yield <=3 errors, % perfect dan % <=3 errors. Yield <=3 errors menunjukkan sebanyak 6.1 Gbp basa pada lajur kontrol yang memiliki tingkat kesalahan di bawah 3 basa. Sebanyak 82% basa yang dihasilkan memiliki kesamaan dengan sekuen PhiX pada % perfect. Sedangkan % <=3 errors menunjukkan sebanyak 97.6% dari total basa yang dihasilkan memilliki tingka kesalahan kurang dari 3 basa.
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell Densitas atau kerapatan klaster dan kualitas selama proses sekuensing dihitung dari proses klaster pustaka genom. Densitas klaster pustaka genom yang dihasilkan berkisar antara 673 – 875 K/mm2 (Tabel 9). Hasil yang didapat tidak ideal dengan Illumina (2009) yang menyatakan bahwa densitas atau kerapatan klaster pustaka genom memiliki nilai ideal antara 400-600 K/mm2. Densitas tinggi yang dihasilkan dapat disebabkan karena konsentrasi pustaka genom yang digunakan pada proses klasterisasi lebih tinggi dari konsentrasi seharusnya yaitu 7 pM atau 13 pM (Quail et al. 2008). Presentase klaster PF menunjukkan kisaran antara 87.2 - 93.3 % klaster yang melewati passing filter. Nilai ini dikategorikan ideal karena >70% (Illumina 2009).
Kualitas hasil sekuensing juga dapat dilihat melalui presentase phasing
dan prepashing. Nilai phasing dan prepashing ini menunjukkan pembacaan basa dari urutan salinan klaster kehilangan sinkronisasi. Presentase phasing yang dihasilkan selama proses sekuensing berlangsung yaitu berkisar antara 0.197 – 0.209 % yang menunjukkan pada kisaran presentase tersebut pembacaan basa berjalan lebih lambat. Sedangkan presentase prepashing berkisar antara 0.241 – 0.324 % yang menunjukkan pada kisaran presentase tersebut pembacaan basa berjalan lebih cepat. Terjadi pashing dan prepashing ini dapat dipengaruhi oleh aliran fluida reagen sekuensing dan reaksi kimia yang terjadi selama proses sekuensing (Illumina 2009). Phasing ini dapat menyebabkan pada siklus selanjutnya tidak ada penempelan basa pada klaster tersebut sehingga pendaran fluorescen yang terbaca bukan berasal dari siklus sintesis basa yang baru melainkan berasal dari pendaran fuorescen hasil sintesis basa sebelumnya.