C. METODA PENELITIAN
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Bakteri Asam Laktat galur SCG 1223 diketahui dapat memproduksi bakteriosin yang memiliki aktivitas hambat terhadap bakteri patogen (E. coli, S. thypimurium, dan L. monocytogenes) (Usmiati et al., 2007). Bakteriosin yang didapatkan dari hasil metabolisme pertumbuhan BAL SCG 1223 yang ditumbuhkan pada kondisi media pertumbuhan pH 5, suhu inkubasi 33,5 oC dengan lama inkubasi 9 jam. Lama waktu pertumbuhan ini merupakan saat dimana berakhirnya fase eksponensial dan merupakan awal fase stasioner pertumbuhan BAL SCG 1223 (Januarsyah, 2007 dan Deba et al., 1991 pada Rahayu E. S. dkk, 2000).
A. Bakteriosin Cair dari BAL SCG 1223
(a)Karakterisasi Bakteriosin terhadap pH dan Suhu
Karakterisasi bakteriosin dilakukan untuk menentukan sifat dari bakteriosin terhadap pengaruh perlakuan lingkungan yaitu suhu dan tingkat keasaman (pH). Suhu yang digunakan antara lain 4oC, 27oC, 55oC, 80oC, dan 100oC, sedangkan pH yang diujikan antara lain pH 2, 4, 7, 10 dan 12. Penentuan sifat bakteriosin dari BAL SCG 1223 dilakukan dengan mengkombinasikan perlakuan pH dan suhu, kemudian didapatkan aktivitas hambat dari pengujian pada bakteri indikator (E. coli, S. thypimurium dan L. monocytogenes) yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2.
Escherichia coli
Pengaruh tingkat keasaman (pH) pada karakterisasi bakteriosin yang diujikan terhadap bakteri Escherichia coli memiliki pengaruh yang nyata terhadap kestabilan aktivitas hambat bakteriosin. Pada Gambar 5, terlihat bahwa adanya pengaruh derajat keasaman terhadap aktivitas hambat yang dihasilkan bakteriosin.Hal tersebut dapat diartikan sebagai pengaruh terjadinya penurunan aktivitas hambat bakteriosin akibat dari penurunan tingkat keasaman lingkungan (Basa). Bakteriosin memiliki aktivitas hambat terbaik pada kondisi asam serta tetap memiliki aktivitas hambat pada kondisi netral hingga basa (pH 7-12).
28
Gambar. 5 Grafik Persentase Perubahan Aktivitas Hambat Bakteriosin SCG 1223 pada Escherichia coli
Kurva diatas menunjukkan perubahan nilai aktivitas hambat bakteriosin cair akibat dari pengaruh tingkat keasaman, pemanasan dan penyimpanan yang diujikan pada bakteri E. coli. Pada perlakuan dengan tingkat keasaman yang tinggi, awal penyimpanan (1 minggu dan 1 bulan) bakteriosin mengalami kenaikan aktivitas hambat 25%-42% yang dibandingkan dengan aktivitas hambat pada hari pertama, namun kemudian menurun pada penyimpanan 3 bulan dan 4 bulan sebesar 30%-65%. Pada perlakuan pH netral, aktivitas hambat bakteriosin hanya terdeteksi pada penyimpanan 1 bulan dan 4 bulan, sedangkan pada perlakuan basa tinggi,dari pengujian aktivitas hambat pada hari ke-1, larutan bakteriosin mengalami penurunan aktivitas hambat pada tingkat 20%-70%.
29
Gambar. 6 Kurva Aktivitas Hambat Bakteriosin SCG 1223 pada Escherichia coli
Perlakuan pemanasan bakteriosin dari BAL SCG 1223 tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas hambat bakteriosin yang dihasilkan pada bakteri E. coli. Pada umumnya memiliki nilai aktivitas hambat yang relatif sama pada seluruh suhu pengujian. Aktivitas hambat bakteriosin tidak mengalami penurunan atau pun kenaikan nilai aktivitas hambat yang signifikan seiring dengan meningkatnya suhu pemanasan. Hal ini sesuai dengan pendapat Bhunia et al (1987), bahwa bakteriosin tetap aktif pada kondisi asam dan basa serta tetap stabil pada perlakuan suhu rendah maupun suhu tinggi
Kombinasi perlakuan pH dan suhu pemanasan bakteriosin dari BAL SCG 1223 memiliki nilai aktivitas hambat tertinggi terhadap bakteri E. coli pada kombinasi perlakuan A1B4 (pH 2, T 80oC) sebesar 2668,40 AU/ml, sedangkan
untuk kestabilan aktivitas hambat bakteriosin terdapat pada perlakuan A1B5 (pH 2,
T 100oC) dengan nilai aktivitas hambat rata-rata sebesar 1957,22 AU/ml. Pada bakteri E. coli, pH 10 merupakan tingkat keasaman sensitif yang memiliki aktivitas hambat terendah dibandingkan dengan perlakuan pH lainnya.
Pada faktor penyimpanan bakteriosin, adanya pengaruh kombinasi perlakuan pH dan suhu pemanasan menjadikan sifat dari bakteriosin dari BAL SCG 1223 lebih spesifik. Tampak pada perlakuan A3 dan A4 (pH 7 dan 10)
merupakan titik sensitivitas dari bakteriosin, dimana pada kondisi tersebut aktivitas bakteriosin tidak dipertahankan maksimal. Namun lain halnya pada
30
perlakuan pH 12, pada kondisi tersebut aktivitas hambat bakteriosin masih lebih dapat dipertahankan dibandingkan pada kondisi pH 7-10. Hal ini mungkin disebabkan oleh terdegradasinya protein bakteriosin oleh mikroorganisme yang tumbuh pada kondisi tersebut. Dari keterangan tersebut dapat diketahui bahwa bakteriosin dari BAL SCG 1223 memiliki aktivitas hambat yang tetap stabil walaupun telah disimpan pada ruang pendingin bersuhu 4oC selama 12 minggu dengan kondisi pH penyimpanan 2-4.
Salmonella thypimurium
Pengaruh tingkat keasaman (pH) pada karakterisasi bakteriosin yang diujikan terhadap bakteri Salmonella thypimurium memiliki pengaruh yang nyata terhadap kestabilan aktivitas hambat bakteriosin. Pada Gambar 8 terlihat bahwa adanya pengaruh penurunan tingkat keasaman terhadap aktivitas hambat yang dihasilkan. Penurunan aktivitash hambat bakteriosin disebabkan oleh menurunya tinkgat keasaman lingkungan bakterioasin (Basa). Bakteriosin memiliki aktivitas hambat terbaik pada kondisi asam serta tetap memiliki aktivitas hambat pada kondisi netral hingga basa (pH 7-12).
Gambar. 7 Grafik Persentase Perubahan Aktivitas Hambat Bakteriosin SCG 1223 pada Salmonella monocytogenes
31
Kurva diatas menunjukkan persentase perubahan aktivitas hambat dari larutan bakteriosin yang dipengaruhi oleh adanya perlakuan tingkat keasaman, pemanasan dan penyimpanan yang kemudian diujikan pada bakteri S. thypimurium. Pada beberapa perlakuan pH rendah pada seluruh perlakuan penyimpanan, bakteriosin mengalami kenaikan aktivitas hambat dibandingkan dengan pengujian pada hari ke-1 dan kemudian menurun aktivitasnya pada penyimpanan 4 bulan. Pada perlakuan pH netral, bakteriosin tidak menunjukkan adanya aktivitas penghambatan, sedangkan pada perlakuan basa bakteriosin mengalami kenaikkan aktivitas hambat hingga penyimpanan bulan ke-3 dan mengalami penurunan pada penyimpanan bulan ke-4.
Gambar. 8 Kurva Aktivitas Hambat Bakteriosin SCG 1223 pada Salmonella thypimurium Perlakuan pemanasan bakteriosin dari BAL SCG 1223 tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas hambat bakteriosin yang dihasilkan pada bakteri S. thypimurium. Pada Gambar 8 dapat dilihat bahwa aktivitas hambat bakteriosin yang dihasilkan memiliki perbedaan nilai yang tidak terlalu signifikan pada seluruh suhu pengujian dalam perlakuan pH yang sama.
Kombinasi perlakuan pH dan suhu pemanasan bakteriosin dari BAL SCG 1223 memiliki nilai aktivitas hambat tertinggi terhadap bakteri S. thypimurium
32
sedangkan untuk kestabilan aktivitas hambat bakteriosin terdapat pada perlakuan A1B4 (pH 2, T 80oC) dengan nilai aktivitas hambat rata-rata sebesar 1889,82
AU/ml. Pada bakteri S. thypimurium, pH 7 dan 10 merupakan tingkat keasaman sensitif yang memiliki aktivitas hambat terendah dibandingkan dengan perlakuan pH lainnya.
Pada faktor penyimpanan bakteriosin, sifat bakteriosin terhadap bakteri S. thypimurium memiliki sifat yang sama dengan penyimpanan bakteriosin terhadap pengujian pada bakteri E. coli. Bakteriosin tidak dapat dipertahankan aktivitas hambatnya pada kondisi penyimpanan pada titik sensitifnya (pH 7-10), namun memiliki aktivitas hambat yang tinggi pada kondisi lingkungan yang asam. Hal ini menjadikan karakter dari bakteriosin yang semakin spesifik yaitu aktif pada kondisi lingkungan yang asam hingga netral, dan mengalami penurunan aktivitas pada kondisi basa. Selain itu, pada kondisi pH 12, aktivitas hambat bakteriosin masih lebih stabil dibandingkan dengan kondisi pH sensitifnya, hal ini kemungkinan disebabkan oleh hal yang sama, yaitu terdegradasinya protein bakteriosin oleh mikroorganisme lain.
Listeria monocytogenes
Pengaruh tingkat keasaman (pH) pada karakterisasi bakteriosin yang diujikan terhadap bakteri Listeria monocytogenes memiliki pengaruh yang nyata terhadap kestabilan aktivitas hambat bakteriosin. Pada Gambar 9 dan dan 10 tampak bahwa terdapat pengaruh dari penurunan tingkat keasaman terhadap aktivitas hambat yang dihasilkan. Dari tabel tersebut juga dapat diartikan bahwa penurunan tingkat keasaman lingkungan akan menurunkan aktivitas hambat bakteriosin hingga kondisi pH netral. Bakteriosin memiliki aktivitas hambat terbaik pada kondisi asam serta menurun aktivitasnya hingga pada kondisi pH netral, kemudian naik kembali nilai aktivitas hambatnya pada kondisi pH basa (pH 10 dan 12).
33
Gambar. 9 Grafik Persentase Perubahan Aktivitas Hambat Bakteriosin SCG 1223 pada Listeria monocytogenes
Persentase perubahan aktivitas hambat bakteriosin dari BAL SCG 1223 dipengaruhi oleh faktor tingkat keasaman, pemanasan dan penyimpanan. Fari kurva diatas dapat dilihat bahwa bakteriosin mengalami penurunan aktivitas hambat pada bakteri Listeria monocytogenes. Nilai aktivitas hambat yang dihasilkan pada umumnya lebih kecil dari pada nilai pengamatan pada hari ke-1. Semakin rendah tingkat keasaman maka akan menurunkan aktivitas hambat pada bateri indikator. Pada bakteri Liseria monocytogenes, aktivitas hambat memiliki nilai yang cukup tinggi namun menurun pada setiap pengujiannya. Sedangkan pada pH netral, bakteriosin tidak menghasilkan aktivitas hambat. Pada perlakuan pH rendah (Basa), terdapat aktivitas hambat bakteriosin, namun mengalami penurunan aktivitasnya.
Perlakuan pemanasan bakteriosin dari BAL SCG 1223 tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas hambat bakteriosin yang dihasilkan pada bakteri L. monocytogenes. Pada Gambar 9 dapat dilihat bahwa aktivitas hambat bakteriosin yang dihasilkan memiliki perbedaan nilai yang tidak terlalu signifikan pada seluruh suhu pengujian dalam perlakuan pH yang sama.
34
Gambar. 10 Kurva Aktivitas Hambat Bakteriosin SCG 1223 pada Listeria monocytogenes
Kombinasi perlakuan pH dan suhu pemanasan bakteriosin dari BAL SCG 1223 dapat dilihat pada Gambar 9, dimana bakteriosin memiliki nilai aktivitas hambat tertinggi terhadap bakteri L. monocytogenes pada kombinasi perlakuan A1B3 (pH 2, T 55oC) sebesar 3887,52 AU/ml, sedangkan untuk kestabilan
aktivitas hambat bakteriosin terdapat pada perlakuan A1B4 (pH 2, T 80oC) dengan
nilai aktivitas hambat rata-rata sebesar 2142,02 AU/ml. Pada bakteri L. monocytogenes, pH 7 merupakan tingkat keasaman sensitif yang memiliki aktivitas hambat terendah dibandingkan dengan perlakuan pH lainnya.
Pada faktor penyimpanan bakteriosin, sama aktivitasnya dengan penyimpanan bakteriosin yang diujikan terhadap bakteri E. coli dan S. thypimurium. Bakteriosin tidak dapat dipertahankan aktivitas hambatnya pada kondisi penyimpanan pada titik sensitifnya (pH 7), namun memiliki aktivitas hambat yang tinggi pada kondisi lingkungan yang asam. Hal ini menjadikan karakter dari bakteriosin yang semakin spesifik yaitu aktif pada kondisi lingkungan yang asam dan mengalami penurunan aktivitas pada kondisi netral, kemudian naik kembali pada kondisi pH 10-12. Pada kondisi pH 10 dan 12, aktivitas hambat bakteriosin masih lebih stabil dibandingkan dengan kondisi pH
35
sensitifnya (pH 7), hal ini kemungkinan disebabkan oleh hal yang sama, yaitu terdegradasi dan teroksidasinya protein bakteriosin oleh mikroorganisme lain.
Tabel 2 Aktivitas Hambat Bakteriosin SCG 1223 Terbaik Terhadap Pengaruh pH dan Suhu.
Bakteri Indikator
Suhu pH
Daya Hambat (AU/ml) (Terbaik)
4°C 27°C 55°C 80°C 100°C E. coli 2 2397,47 2131,36 2096,45 2668,40 2176,00 4 1256,00 973,89 730,55 1164,43 1562,64 7 1160,33 716,55 1542,13 1141,78 0,00 10 312,60 283,55 368,20 0,00 0,00 12 427,25 903,25 441,55 468,50 918,65 S. thypimurium 2 2559,49 2409,36 2844,15 2512,00 1890,67 4 1121,33 2007,10 1352,95 1284,11 1380,42 7 1355,79 1004,80 122,65 0,00 695,61 10 647,23 866,74 444,41 255,12 307,82 12 745,17 815,03 710,99 863,24 780,18 L. monocytogenes 2 3177,21 2592,50 3887,52 2414,07 1967,90 4 2397,89 339,30 3210,85 1844,00 2793,46 7 1771,75 1660,20 1605,95 1307,03 1802,99 10 1843,97 711,40 883,22 1000,48 1295,45 12 1263,10 1256,18 1098,56 1241,87 1100,56
Bakteriosin yang telah diberi perlakuan pH dan suhu menunjukkan adanya spektrum aktivitas hambat yang bervariasi terhadap bakteri indikator (Escherichia coli, Salmonella thypimurium, dan Listeria monocytogenes), Hasil pengujian aktivitas hambat pada umum terdapat pada perlakuan A1B3 (pH 2 dengan
pemanasan selama 5-10 menit pada 55oC) sebesar 3887,52 AU/ml. Bakteriosin dari BAL SCG 1223 stabil pada kondisi pH penyimpanan rendah (pH 2-4) pada ruang pendingin bersuhu 4oC selama 12 minggu penyimpanan. Perbedaan aktivitas hambat bakteriosin pada setiap bakteri indikator menunjukkan bahwa
36
bakteriosin memiliki kemampuan menghambat yang berbeda-beda pada setiap bakteri indikator yang diujikan karena berkaitan dengan dekat atau tidaknya kekerabatan antara BAL penghasil bakteriosin dengan bakteri yang diujikan.yaitu antara lain beasal dari jenis bakteri Gram- positif dan bakteri Gram- negatif.
Pada bakteri Listeria monocytogenes yang merupakan bakteri Gram-
positif, bakteriosin memiliki aktivitas hambat yang lebih tinggi dibandingkan dengan bakteri Escherichia coli dan Salmonella thypimurium yang merupakan bakteri Gram- negatif. Perbedaan ini dikarenakan oleh BAL SCG 1223 penghasil bakteriosin termasuk dalam jenis bakteri Gram- positif, yang merupakan jenis bakteri yang berada pada filial kekerabatan yang sama dengan bakteri penghasil bakteriosin. Selain itu, pada bakteri Gram- negatif memiliki lapisan membran luar yang dapat melindungi dirinya dari pengaruh zat antimikroba yang diberikan padanya sehingga beberapa bakteri Gram- negatif menjadi tidak sensitif terhadap bakteriosin, hal ini sependapat dengan Kordel dan Sahl, pada tahun 1986.
b) Aktivitas Hambat Bakteriosin dari BAL SCG 1223
Aktivitas hambat bakteriosin yang mendapat perlakuan karakterisasi ( pH dan suhu) memiliki aktivitas hambat tertinggi pada setiap bakteri uji antara lain 2668,40 AU/ml pada E. Coli 2844,15 AU/ml pada S.thypimurium, dan 3887,52 AU/ml pada L. Monocytogenes. Aktivitas hambat tersebut pada umumnya dipengaruhi oleh adanya perlakuan tingkat keasaman lingkungan sedangkan perlakuan pemanasan tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas hambat yang dihasilkan.
Bakteriosin cair yang berasal dari BAL SCG 1223 memiliki aktivitas hambat sebesar 477,79 AU/ml pada bakteri E. coli, 383,27 AU/ml pada bakteri S. thypimurium dan pada bakteri L. monocytogenes sebesar 589,133 AU/ml dengan asumsi konsentrasi bakteriosin cair murni (kering) sebesar 0,00049 gram (b/b) atau sebanyak 9,7 µl bakteriosin cair.