Penelitian uji pelepasan obat (release) bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan pelepasan obat antara bisfosfonat murni (sodium risedronat) dengan sodium risedronat yang dibawa media hidrogel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bisfosfonat risedronat murni langsung terlepas dalam jumlah besar diawal pencampuran dengan larutan BPS. Sodium risedronat murni yang dibawa oleh media pembawa hidrogel gelatin menunjukkan pelepasan obat yang lebih lambat. Pada saat matrik gelatin mengalami degradasi maka sodium risedronat akan terlepas secara perlahan lahan sehingga dapat berefek lokal.
Menurut Ganji dkk. (2009), hidrogel bersifat porus (berpori) sehingga suatu substansi dapat disisipkan ke dalam matriks gel dengan laju pelepasan yang disesuaikan. Molekul molekul suatu substansi yang akan dibawa oleh sistem hidrogel tersebut akan terperangkap dalam jaring-jaring gel sampai gel mengalami degradasi (Arora, 2002). Hidrogel yang terdegradasi menyebabkan pelepasan suatu substasi yang dibawanya. Laju dan kecepatan pelepasan zat aktif dari matriks
70 hidrogel tergantung dari laju migrasi air menuju matriks dan laju difusi obat keluar dari matriks yang membengkak (Troy, 2006). Keuntungan penggunaan gelatin adalah sifat gelatin yang mudah terdegradasi secara biologis dalam jaringan sehingga cocok digunakan sebagai media pembawa (Bregg, 2005). Hidrogel dapat digunakan untuk mengontrol pelepasan obat sehingga obat dapat bekerja lebih optimal pada aplikasi topikal (Boateng dkk., 2008).
Hidrogel memiliki sifat hidrofil yaitu kemampuan untuk membengkak dalam air dan pelarut lainnya (Gao dkk., 2007), dapat mengalami imbibisi, dan mempertahankan lebih dari 10% berat dalam air dalam bentuk struktur gel (Bregg, 2005). Hidrogel dapat menggembung (swell) tetapi tidak mengalami pelarutan (dissolve) di dalam air. Penggembungan hidrogel ini merupakan konsekuensi dari adanya gugus fungsional yang hidrofilik yang melekat pada jaring polimer (Troy, 2006) yaitu residu kimiawi seperti hydroxylic, carboxylic, amidic, primary amidic, sulphonic, dan senyawa lain yang dapat ditemukan pada rantai lateral polimer (Ganji dan Faharani, 2009). Hidrogel yang membengkak dapat menyebabkan obat berdifusi keluar dari jaring makromolekul ketika hidrogel diletakkan dalam lingkungan yang berair (Troy, 2006).
Zat aktif bisfosfonat risedronat yaitu sodium risedronat yang dibawa oleh sistem hidrogel gelatin akan terperangkap dalam jaring-jaring gel dan ketika dilarutkan dalam air, hidrogel akan menggembung (swelling) sampai gel mengalami degradasi dan sodium risedronat akan berdifusi keluar, sehingga laju pelepasan zak aktif sodium risedronat menjadi lebih lambat dan dapat berefek topikal.
71
1. Pengaruh Pemberian Bisfosfonat Risedronat Terhadap Relaps Gigi
Hasil penelitian menunjukkan sediaan bisfosfonat risedronat dengan media pembawa hidrogel gelatin efektif menurunkan pergerakan relaps gigi mulai hari ke- 14, yang ditunjukkan dengan adanya perbedaan jarak relaps yang signifikan antara kelompok yang diberi obat dan tidak. Hasil penelitian ini sesuai dengan beberapa penelitian sebelumnya yang menyimpulkan bahwa bisfosfonat efektif menurunkan pergerakan gigi ortodontik. Penelitian Keles dkk. (2007) pada mencit dengan memberikan bisfosfonat didapatkan gigi yang terhambat pergerakannya dan penurunan jumlah osteoklas. Mencit yang mendapatkan pemberian bisfosfonat menunjukkan terjadinya apoptosis osteoklas dan penurunan pergerakan gigi di bawah tekanan ortodontik yang konstan. Penelitian Choi K dkk. (2010) menyimpulkan terjadi penurunan pergerakan gigi secara ortodontik dan peningkatan durasi perawatan berdasarkan analisis histophotometric setelah pemberian bisfosfonat klorodonat pada tikus. Efek bisfosfonat zoledronate yang diteliti pada tikus wistar oleh Sirisoontorn dkk. (2012) menunjukkan hasil terjadi hambatan pergerakan gigi dan resorbsi akar yang distimulasi perawatan ortodontik. Penelitian secara klinis pada pasien dewasa yang menggunakan alat ortodontik dan mengkonsumsi bisfosfonat dilaporkan mampu memperlebar jarak periodontal ligamen, zona sklerotik di sekitar gigi, dan hipermineralisasi pada tulang alveolar. Seluruh perubahan ini dapat memperlambat waktu perawatan dan menurunkan kemampuan gigi untuk bergerak, bahkan mempersulit penutupan ruang yang dihasikan pasca ekstraksi, paralelisme akar yang baru, dan terjadinya pergerakan gigi. Kejadian ini disebabkan adanya ekspresi aktivitas anti resorbsi tulang rahang
72 pada orang yang mengkonsumsi bisfosfonat dan menggunakan alat ortodontik (Zahrowski, 2007).
Zat aktif bisfosfonat risedronat yaitu sodium risedronat yang dibawa oleh sistem hidrogel gelatin terperangkap dalam jaring-jaring gel sampai gel mengalami degradasi sehingga laju pelepasan zak aktif risedronat sodium menjadi lebih lambat dan dapat berefek topikal. Hari ke-3 dan ke-7 tidak menunjukkan perbedaan penurunan jarak relaps yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa bisfosfonat risedronat belum memberikan pengaruh dan kemungkinan jaringan periodontal masih menjadi faktor penyebab relapsnya gigi di awal pelepasan alat ortodontik. Hasil penelitian sebelumnya oleh Tanya dkk. (2011) menyatakan bahwa relaps terjadi dengan cepat pada saat awal alat ortodontik dilepas. Serabut principal PDL oleh beberapa peneliti dianggap bertanggung jawab atas terjadinya relaps setelah perawatan ortodontik. Selama pergerakan gigi serabut ini akan mengalami peregangan (membentang) di sisi yang terjadi ketegangan oleh adanya aplikasi tekanan, kemudian tertanam dalam tulang yang baru. Serabut ini akan lebih atau berkurang memanjang secara permanen, dan penataan ulang dari serabut ini serta tulang alveolar setelah tidak adanya tekanan akan menyebabkan relaps (Jaap dan Anne Marie, 2009). Selama pergerakan gigi ortodontik, serabut PDL di sisi ketegangan berkembang hanya dalam arah gerakan. Bila tulang baru belum terbentuk di antara serabut PDL, maka stimulasi relaps dapat terjadi segera setelah hilangnya gaya ortodontik (Thilander, 2000).
73
2. Pengaruh Bisfosfonat Risedronat Topikal Terhadap Penurunan Jumlah Osteoklas
Hasil penelitian menunjukkan bisfosfonat risedronat dengan media pembawa hidrogel sangat efektif menurunkan jumlah osteoklas. Bisfosfonat merupakan analog sintetik pirofosfat inorganik (PPi). Pada struktur pirofosfat oksigen diikat oleh fosfat (P-O-P), namun pada struktur bisfosfonat molekul oksigen digantikan oleh atom karbon (P-C-P). Ikatan P-C-P memberikan resistensi terhadap degradasi enzim dan ikatan yang kuat terhadap kalsium hidroksi apatit dari struktur tulang (Rodan dan Reszka, 2002). Dilihat dari strukturnya, bisfosfonat dapat dibedakan menjadi 2 macam yaitu bisfosfonat sederhana atau simple-BPs dan bisfosfonat yang mengandung atom nitrogen atau N-BPs (Rogers, 2003). Keberadaan atom nitrogen atau group amino akan meningkatkan potensi anti-resorptif BPs bila dibandingkan dengan BPs yang tidak mengandung nitrogen (ataupun group amino). Non-nitrogen BPs merupakan BPs generasi awal (seperti etidronat, klodronat, dan tiludronat) yang memiliki struktur paling mirip dengan PPi. Berbeda dengan BPs gerenasi awal, BPs generasi ke-2 dan 3 (seperti alendronat, risendronat, ibandronat, pamidronat, dan asam zoledronik) memiliki kandungan nitrogen pada sisi rantai R2 (Drake dkk., 2008). Adapun N-BPs (seperti
pamidronate, alendronate, dan risendronate) akan menghambat farnesyl pyrophosphate synthase (enzym dalam jalur mevalonate). Penghambatan ini akan menyebabkan tidak terbentuknya isoprenoid geranylgeranyl pyrophosphate
(GGPP). Dengan tidak terbentuknya GGPP, maka tidak terjadi prenilasi beberapa protein-protein kecil GTPase (contohnya Ras, Rho, dan sebagainya) yang bertanggung jawab dalam integritas sitoskeletal dan signaling intrasel pada sel
74 osteoklas. Tidak adanya integritas sitoskeletal sel osteoklas menyebabkan ruffled border tidak terbentuk sehingga osteoklas tidak dapat melakukan aktivitas resorpsi dan mengalami apoptosis (Ghoneima dkk., 2010).
Molekul target lainnya dari bisfosfonat adalah pompa proton tipe vakuola dependen-ATP dalam ruffled border osteoklas, yang dibutuhkan dalam pengasaman lakuna resorbsi serta untuk melarutkan mineral-mineral tulang. Bisfosfonat telah diketahui dapat menghambat ativitas beberapa enzym hidrolitik tertentu secara langsung, seperti metalloprotease, phosphatase, dan asam
phosphohydrolase. Selain itu bisfosfonat juga memainkan perannya dalam
penghambatan protein tyrosin phosphatase (PTPs), suatu enzim esensial baik untuk pembentukan osteoklas dan juga aktivitas resorbsi osteoklas (Rogers, 2003). Beberapa penelitian terakhir menyatakan bahwa risedronat merupakan obat pilihan karena tingginya potensi dan kurangnya efek yang merugikan jika dibandingkan dengan bisfosfonat yang lain (Robert sit Joel dkk., 2001).
3. Pengaruh Pemberian Bisfosfonat Risedronat Terhadap Rasio Jumlah Osteoklas dan Osteoblast Dengan Pewarnaan HE
Ligamen periodontal dan tulang alveolar adalah dua struktur penting yang secara aktif berperan dalam proses remodeling tulang sebagai respon terhadap kekuatan mekanik. Fibroblast, osteoblas, osteosit, osteoklas, odontoblasts, cementoblasts, kondrosit dan sel-sel kekebalan (immune cells) adalah jenis sel utama yang memiliki peran interaktif dalam proses remodeling (Nayak dkk., 2013). Proses remodeling dilakukan terutama oleh sel-sel osteoklas dan osteoblas. Osteoklas bertanggungjawab untuk resorpsi tulang dan berasal dari stem cells
75 hematopoetik yang dikenal dengan monosit, sedangkan osteoblas bertanggung jawab untuk pembentukan tulang dan berasal dari sumsum tulang stromal cells (Idris dkk., 2005; Kruger dkk., 2010; Henriksen dkk., 2011).
Proses remodeling mempertahankan ketebalan tulang dan hubungan antara gigi dengan tulang alveolus relatif konstan. Soket gigi seperti bergerak sejalan dengan pergerakan gigi pada tulang alveolus, merupakan fenomena adaptasi yang disebutkan Hukum Wolf, yaitu tulang akan membentuk dan mengurangi massa karena tekanan, untuk mengimbangi tekanan tersebut (Foster, 1993). Aksioma dasar perawatan ortodontik adalah “bone traces tooth movement” (tulang mengikuti jejak gerakan gigi), yang berarti jika terjadi gerakan gigi secara ortodontik tulang disekitar soket alveolus akan remodeling dalam derajat yang sama besar (Reitan, 1964). Sehingga berkembang rasio remodeling tulang (bone/B) dengan gerakan gigi (teeth/T) (B:T) 1:1 (Vardimon dkk, 1998).
Penghitungan jumlah osteoklas dan osteoblas pada daerah tekanan selama pergerakan relaps ini bertujuan untuk mendapatkan rasio antara osteoklas dan osteoblas sehingga dapat diketahui dominasi aktivitas kedua sel tersebut. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa osteoblas lebih dominan dibanding osteoklas pada ketiga kelompok baik pada hari ke-0,3,7,14 dan 21, menunjukkan aktivitas osteoblas dalam proses pembentukan tulang lebih dominan daripada osteoklas selama pergerakan relaps gigi.
Berdasarkan hasil penelitiannya, Tanya dkk. (2011) menyatakan bahwa pergerakan gigi ortodontik dan relaps akan menunjukkan proses yang sama. Pada sisi yang merupakan area regangan (tension side) pada saat pergerakan gigi aktif akan dapat berubah menjadi area tekan (pressure side) pada saat pergerakan relaps
76 (Jaap dan Anne, 2009). Setelah pelepasan alat ortodontik, gigi mulai relaps bergerak ke arah posisi semula. Gerakan ini disertai dengan perubahan jumlah dan distribusi osteoklas. Jumlah osteoklas menurun secara signifikan di kedua akar mesial dan distal dari molar pertama dalam waktu 3 hari, kemungkinan besar akibat apoptosis dan atau kepadatan pembuluh darah menurun (Murrell dkk., 1996; Noxon dkk., 2001). Jumlah osteoklas menurun lebih lanjut pada hari ke-14 dan mulai stabil pada hari ke-14 sampai 21 periode relaps (Tanya dkk., 2011).
Hasil penelitian ini menunjukkan perbedaan yang signifikan jumlah osteoblas pada hari ke-3 dan 7 dimana kelompok B dan C (dengan bisfosfonat) lebih tinggi dari pada kelompok A (tanpa bisfosfonat). Hasil penelitian Fabian dkk. (2005) menggunakan model in vitro yang relevan secara klinis, menunjukkan bahwa bisfosfonat meningkatkan proliferasi BMSC (bone marrow stromal cells) dan menginisasi diferensiasi osteoblastik. Meskipun aksi utama bisfosfonat adalah penghambatan resorpsi tulang oleh osteoklas (Rodan dkk., 2000), terdapat peningkatan bukti bahwa bisfosfonat juga berinteraksi dengan osteoblas (Fabian dkk., 2005). Secara simultan tampak bahwa bisfosfonat memiliki efek anabolik pada osteoblas. Penelitian terbaru dari beberapa kelompok peneliti menunjukkan bahwa bifosfonat meningkatkan proliferasi dan pematangan / maturasi osteoblas (Reinholz, 2000; Fromigue dan Body, 2002; Im dkk., 2004) dan menghambat apoptosis (Plotkin dkk., 1999).
Mekanisme efek anabolik bifosfonat terhadap proliferasi dan diferensiasi osteogenik dari BMSC tidak sepenuhnya dipahami. Menurut Giuliani dkk. (1995), efek anabolik bifosfonat adalah karena stimulasi b-FGF pada osteoblas. Mundy dkk. (1999) menyatakan bahwa statin yang menghambat jalur mevalonate,
77 merangsang osteoblas dengan menginduksi ekspresi gen BMP-2 (Fromigue dan Body, 2002). BMP-2 adalah agen osteokonduktif dan faktor pertumbuhan yang poten yang terlibat dalam perekrutan, proliferasi dan diferensiasi sel-sel progenitor mesenchymal, dan akhirnya menghasilkan produksi jaringan tulang (Wozney, 1989). Pematangan osteoblas setelah pengobatan bifosfonat juga melibatkan peningkatan regulasi yang kuat dari ekspresi gen BMP-2 (Im dkk., 2004).
4. Pengaruh Pemberian Bisfosfonat Risedronat Terhadap Kadar Alkalin Fosfatase
Pengambilan cairan krevikuler gingiva untuk mengetahui kadar ALP dilakukan pada hari ke-0 (pada saat lingual bonding cleat dan open coil spring
dilepas) sebagai baseline. Perubahan yang langsung terjadi pada periodonsium dan pergerakan cepat gigi pada area PDL merupakan perkiraan terbaik untuk mengetahui aktivitas enzim pada hari ke-3 setelah alat ortodontik dilepas. Pada hari ke-7 aktivitas enzim diharapkan menunjukkan secara tepat fase akhir pergerakan gigi saat hylanisasi terjadi, dan pada hari ke-14 dan hari-21 aktivitas enzim terfokus pada kelanjutan fase atau dimulainya post lag phase (fase akhir).
Pada penelitian ini kadar ALP pada cairan krevikuler gingiva dapat terdeteksi menggunakan spectrophotometer dengan panjang gelombang 450 nm dengan p- nitrophenol sebagai larutan standar. Uji ALP dilakukan pada pergerakan relaps, dimana sudah tidak diberikan tekanan ortodontik. Asam dan alkaline fosfatase dilepaskan (release) oleh perlukaan serta kerusakan dan kematian cairan jaringan ektraseluler. Sebagai akibat aplikasi gaya secara ortodontik, enzim tersebut diproduksi oleh periodonsium dan berdifusi pada GCF. Aktivitas monitoring
78 fosfatase pada GCF dapat menjadi penyebab perubahan jaringan yang terjadi selama pergerakan gigi secara ortodontik. Studi ekperimental pada tikus menunjukkan aktivitas fosfatase dapat merefleksikan bone turnover pada gigi yang digerakkan secara ortodontik (Keeling dkk., 1993).
Pada penelitian ini diperoleh hasil tidak terdapat perbedaan rata-rata yang signifikan kadar ALP antar kelompok A,B, dan C pada hari ke-0,3 dan 7, namun terdapat perbedaan bermakna pada hari ke 14 dan 21. Yokoya dkk. (1997) melaporkan bahwa osteoklas pada area tekanan meningkat jumlahnya pada hari ke- 7 dan menurun dengan cepat pada hari ke-14. Ketika aktivitas enzim tinggi pergerakan gigi semakin besar. Hal ini secara tidak langsung menyatakan bahwa aktivitas ALP diikuti tingkat pergerakan gigi selama fase inisial.Studi klinis pada manusia menunjukkan terdapat korelasi antara remodeling tulang alveolar dengan perubahan aktivitas pada fosfatase GCF (Insoft dkk., 1996). Proses remodeling tulang yang lebih kompleks terjadi, ditandai aktivitas resorbsi inisial (3-5 hari) dan diikuti penulangan pada (5-7 hari), dan fase akhir deposisi tulang (7-14 hari) yang terjadi baik pada area tensi maupun kompresi pada dinding tulang alveolar. Pada fase awal resorbsi tulang lebih banyak dibandingkan dengan deposisi tulang, akan tetapi pada fase berikutnya resorbsi dan deposisi menjadi sinkron (King dkk. cit Batra, 2006).Pengukuran kadar ALP pada penelitian ini adalah pada pergerakan relaps saat sudah dilakukan stabilisasi selama kurang lebih 1 minggu sehingga kemungkinan sudah terjadi fase sinkron antara resorbsi dan deposisi, sehingga tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada hari ke-0,3 dan 7. Pada hari ke 14 dan 21 mulai tampak efek dari hidrogel bisfosfonat risedronat dimana terdapat perbedaan yang signifikan baik pada jarak relaps maupun kadar ALP antara
79 kelompok tanpa bisfosfonat (A) dengan kelompok yang mendapatkan injeksi bisfosfonat (B dan C). Hasil ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Batra dkk. (2006) yang menunjukkan terdapat perubahan yang signifikan (p<0.05) aktivitas alkalin fosfatase pada hari ke-7, 14, dan 21 baik pada sisi mesial maupun distal antara sisi eksperimental dibandingkan dan sisi kontrol. Puncak aktivitas enzim terjadi pada hari ke-14 dari awal retraksi diikuti dengan penurunan aktivitas yang signifikan terutama pada sisi mesial.
Area yang merupakan area tarik pada saat pergerakan gigi aktif akan berubah menjadi area tekan pada saat relaps (Jaap dan Anne Marie, 2009). Anyaman tulang yang terlihat pada akhir perawatan ortodontik merupakan tulang yang rawan terhadap terjadinya relaps. Penghambatan resorpsi tulang terhadap anyaman tulang ini dengan pemberian bisfosfonat memungkinkan dapat meningkatkan stabilitas gigi yang sudah digerakkan (Shetty dkk., 2006). Selama pergerakan gigi, serabut PDL di sisi ketegangan berkembang hanya dalam arah gerakan. Selama tidak ada tulang baru terbentuk diantara serabut ini, dapat menstimulasi terjadinya relaps segera setelah hilangnya gaya ortodontik (Thilander, 2000). Bifosfonat meningkatkan proliferasi dan pematangan/maturasi osteoblas (Reinholz, 2000; Fromigue dan Body, 2002; Im dkk., 2004). Osteoblas matur akan mensekresi osteoid, kolagen tipe I, faktor pertumbuhan, dan alkalin fosfatase. Proses pembentukan tulang terjadi melalui tiga proses yaitu produksi (proliferasi), maturasi matrik osteoid, kemudian dilanjutkan dengan mineralisasi (Baron dkk., 2002; Lerner, 2004). Selama proliferasi beberapa protein matrix ekstra seluler (procollagen I, TGF-ß, dan fibronectin) dapat dideteksi. Fase maturasi matriks ditandai dengan adanya ekspresi alkaline phosphatase (ALP) (Karperk, 1995).
80 Bifosfonat pada awalnya memicu ekspresi gen faktor transkripsi osteogenik utama termasuk BMP-2 dan-cbfa 1, dengan bertindak sebagai pemicu diferensiasi secara berurutan yang secara sekunder menyebabkan terjadinya komitmen yang jelas yaitu diferensiasi dan pematangan pluripotential BMSC terhadap fenotip osteoblas. Cbfa-1 merupakan faktor transkripsi yang memainkan peran penting dalam osteogenesis. Hal ini dianggap sebagai faktor transkripsi kunci untuk diferensiasi osteoblas (Fromigue dan Body, 2002).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa bisfosfonat risedronat hidrogel efektif menghambat pergerakan relaps. Dengan media pembawa gelatin hidrogel sodium risedronat murni akan berdifusi keluar saat hidrogel mengalami degradasi sehingga dapat berefek lokal. Sediaan ini juga efektif menurunkan jumlah osteoklas yang berperan dalam proses resorpsi sehingga terjadi penghambatan resorpsi anyaman tulang baru, serta efektif meningkatkan jumlah osteoblas yang berperan dalam proses pembentukan tulang baru dimana bisfosfonat meningkatkan proliferasi dan pematangan/maturasi osteoblas yang ditandai dengan adanya perbedaan peningkatan kadar alkaline fosfatase.
81
V. KESIMPULAN DAN SARAN