Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetika Alternatif
Transformasi genetika merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman dan untuk analisis fungsi gen. Diantara berbagai teknik transformasi genetika yang telah dikembangkan saat ini, teknik transformasi Agrobacterium merupakan teknik transformasi yang paling umum digunakan. Keunggulan teknik transformasi genetika menggunakan bantuan Agrobacterium adalah tidak diperlukan peralatan yang canggih dan kemungkinan untuk mendapatkan tanaman transgenik dengan salinan gen tunggal lebih tinggi dibandingkan dengan teknik transformasi genetika lain. Namun, teknik transformasi Agrobacterium telah dipatenkan sehingga menghambat pemanfaatannya untuk pengembangan pertanian terutama untuk negara berkembang.
Penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transformasi genetika memungkinkan untuk dilakukan dengan melibatkan T-DNA dan gen-gen virulen dari plasmid Ti yang telah dimodifikasi, meskipun efisiensi transformasinya rendah. Broothaerts et al. (2005) dan Wendt et al. (2010) menggunakan bakteri pembentuk bintil akar (Rhizobia) dalam transformasi genetika beberapa tanaman termasuk padi, tembakau, Arabidopsis, dan kentang. Evaluasi efisiensi bakteri selain Agrobacterium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman dibandingkan dengan A. tumefaciens perlu dilakukan sebagai langkah awal dalam pengembangan transformasi genetika tanaman menggunakan bakteri selain Agrobacterium. Untuk tujuan tersebut Rhizobium leguminosarum ANU845 dibandingkan dengan Agrobacterium tumefaciens LBA288
Hasil evaluasi terhadap efektifitas R. leguminosarum dalam mentransfer gen ke dalam tiga genotipe padi menunjukkan R. leguminosarum ANU845 yang telah direkayasa mampu mentransfer gen dengan efektifitas sama dengan A. tumefaciens LBA288. Berdasarkan efisiensi regenerasi dan transformasi, ekspresi gen (gus dan hpt), jumlah salinan gen target, pola pewarisan gen, serta pertumbuhan dan fertilitas tanaman tanaman hasil transformasi dengan kedua sistim transformasi (Tabel 13), R. leguminosarum efektif dalam melakukan
transfer gen. Oleh karena itu bakteri Rhizobium leguminosarum sangat potensial digunakan sebagai agen transformasi alternatif pada tanaman padi.
Aspek penting lain yang juga perlu dilihat adalah kemungkinan penyisipan daerah di luar DNA. Penyisipan daerah tulangpunggung plasmid di luar T-DNA ini tidak diinginkan, terutama jika disertai dengan penyisipan gen penyandi antibiotik (misalnya, ampisilin, tetrasiklin) yang tidak diperbolehkan ada di dalam tanaman transgenik, sehingga dapat menimbulkan masalah dalam pelepasan (EFSA 2004). Kemungkinan penyisipan daerah di luar T-DNA pada transformasi menggunakan Agrobacterium adalah 20-30% (Martineau et al. 1994), sedangkan Rhizobium belum diketahui.
Keberhasilan transformasi menggunakan bakteri Rhizobia sangat tergantung pada genotipe tanaman serta species atau strain bakteri yang digunakan (Broothearts et al. 2005, Wendt et al. 2010). Selain itu, bahan tanaman (eksplan) yang digunakan sangat berpengaruh terhadap keberhasilan transformasi. Beberapa protokol transformasi Agrobacterium yang sesuai untuk genotipe tanaman padi tertentu telah dikembangkan (Hiei & komari 2008). Protokol ini mungkin dapat diaplikasikan pada transformasi genetika padi menggunakan Rhizobium atau bakteri selain Agrobacterium agar diperoleh efisiensi transformasi yang lebih tinggi.
Rhizobium leguminosarum sangat potensial digunakan sebagai agen transformasi alternatif pada tanaman. Agar teknik transformasi genetika menggunakan perantara Rhizobium dapat digunakan lebih luas di masa mendatang maka tersedianya plasmid yang lebih kecil dan mudah dimanipulasi secara in vitro diperlukan. pCAMBIA 5106 adalah plasmid cointegratif yang memiliki ukuran yang besar (∼42 Kb) dan situs restriksi unik yang diperlukan untuk proses kloning gen sangat terbatas. Oleh karena itu, meskipun pCAMBIA 5106 masih dapat digunakan, penggunaan plasmid yang lebih mudah dimanipulasi secara invitro (plasmid biner) akan lebih bermanfaat.
75
Tabel 13 Perbandingan antara transformasi menggunakan bantuan A. tumefaciens dengan R. leguminosarum
Parameter Agen transformasi
A. tumefaciens R.leguminosarum
Efisiensi regenerasi 4,85 – 37,21 5,84 – 59,38 Efisiensi transformasi 1,14 – 3,41 2,05 – 12,05 Jumlah tanaman
mengekspresikan gen hpt >80% >60% Rata-rata jumlah salinan gen 1,35 1.20
Pola segregasi gen Mendel Mendel
Fenotipe Normal, fertil Normal, fertil
Pendekatan Reverse Genetic untuk Mempelajari Peranan Gen OsHox6 Untuk mempelajari fungsi gen OsHox6 diperlukan tanaman transgenik yang ekspresi gen OsHox6-nya diubah dari kondisi normalnya, yaitu dengan meningkatkan ekspresi (overekspresi) dan menghilangkan ekspresi (knockout) OsHox6. Untuk meningkatkan expresi gen OsHox6, tanaman padi ditransformasi menggunakan plasmid mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Hasil transformasi tanaman padi diperoleh 6 galur tanaman padi varietas IR64 transgenik yang mengandung satu salinan gen tunggal dan bersegregasi 3:1 berdasarkan PCR hpt. Namun, konfirmasi lebih lanjut mengenai level ekspresi gen OsHox6 pada tanaman transgenik masih perlu dilakukan. Tanaman transgenik OsHox6 yang diharapkan mengoverekspresikan OsHox6 ini selanjutnya digunakan untuk analisis selanjutnya. Sebaliknya, tanaman yang tidak mengekspresikan OsHox6 belum diperoleh sehingga data atau informasi mengenai pengaruh peniadaan ekspresi gen OsHox6 tidak dapat dilaporkan. Regulasi gen OsHox6 diprediksi menggunakan analisis bioinfomatik promoter gen OsHox6, sedangkan analisis pola ekspresi gen OsHox6 dilakukan dengan menggunakan padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor β-glucuronidase.
Analisis bioinfomatik promoter gen OsHox6 menunjukkan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan dan ABA ditandai oleh adanya cis- acting elemen yang penting untuk respon kekeringan (MYB1 dan MYC, ABRE like/ERD1, ERD1, dan LTRE) dan respon ABA (ABRE related sequences,
CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2). Keberadaan elemen cis-acting terkait respon kekeringan merupakan salah satu petunjuk awal bahwa aktivitas promoter diregulasi oleh kekeringan, meskipun tidak ada jaminan efektifitas ekspresi gen. Oleh karena itu analisis fungsi dari kandidat promoter perlu dilakukan dengan menggabungkan kandidat promoter dengan suatu gen pelapor dan mengujinya pada kondisi cekaman kekeringan.
Hasil analisis ekspresi gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6 padi menunjukkan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan. Ekspresi gen OsHox6, yang disimpulkan dari pola ekspresi fusi promoter OsHox6 dengan gen GUSPlus, menunjukkan aktivitas promoter OsHox6 meningkat pada saat ada cekaman kekeringan. Ekspresi GUSPlus diakumulasikan pada jaringan muda yang aktif membelah (buku batang, daerah pertemuan antara helaian daun dengan pelepah daun, dan dasar bunga), mengindikasikan bahwa ekspresi gen OsHox6 tinggi pada jaringan meristematis. Pola ekspresi OsHox6 pada batang berbeda dengan organ lainnya. Pada batang ekspresi GUSPlus dapat diamati pada tahap awal dehidrasi, sedangkan pada akar, daun dan bunga ekspresi GUSPlus baru dapat diamati setelah tanaman mengalami kekeringan lebih lanjut (6-7 hari), mengindikasikan adanya kemungkinan mekanisme regulasi gen OsHox6 yang berbeda pada batang dan organ lainnya.
Pola ekspresi GUSPlus yang dikendalikan promoter OsHox6 ini mirip dengan ekspresi gen TLD1/OsGH3.13 yang terkait dengan keseimbangan hormon pertumbuhan auksin (IAA) (Zhang et al. 2009). Hormon pertumbuhan dilaporkan berinteraksi dengan gen HD-Zip sub-famili I. Deng et al. (2006) melaporkan tanaman yang mengoverekspresikan CpHB-7 (HD-Zip I) menjadi kurang sensitif terhadap ABA selama perkecambahan. Selanjutnya OsHox4 berfungsi sebagai represor dalam respon giberelin (Dai et al. 2008), menyebabkan tanaman menjadi kerdil akibat panjang sel berkurang. Berdasarkan hasil penelitian ini diduga OsHox6 berperan dalam pengaturan pertumbuhan tanaman padi dalam respon terhadap cekaman kekeringan. Interaksi antara hormon pertumbuhan dengan OsHox6 belum diketahui. Penelitian lebih lanjut untuk mempelajari pengaruh hormon terhadap ekspresi gen yang dikendalikan oleh promoter OsHox6 akan dilakukan.
77
Evaluasi awal tingkat toleransi galur padi transgenik OsHox6 terhadap kekeringan mengindikasikan bahwa gen OsHox6 berperan penting dalam mekanisme toleran kekeringan pada tanaman padi. Empat (IR64 I.23, I.40, I. 19, dan I.33) dari enam galur padi transgenik OsHox6 yang diuji menunjukkan tingkat toleransi yang lebih tinggi dari kontrol tipe liarnya berdasarkan pengamatan terhadap tingkat recovery dari masing-masing galur. Persentase recovery tanaman setelah diberi perlakuan cekaman kekeringan selama 14 hari digunakan sebagai indikator awal tanaman toleran kekeringan. Evaluasi lebih lanjut akan dilakukan pada fase pertumbuhan generatif menggunakan galur stabil (homozigot) yang mengoverekspresikan OsHox6. Hasil pengamatan terhadap tinggi tanaman padi transgenik hasil transformasi gen OsHox6 yang dikendalikan promoter terinduksi kekeringan menunjukkan tidak ada perbedaan antara tanaman transgenik dengan tanaman kontrol padi tipe liarnya.
Upaya Lebih Lanjut Analisis Fungsi Gen OsHox6 pada Tanaman Padi
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui cara kerja OsHox6 dalam merespon kekeringan. Identifikasi gen-gen yang ekspresinya berubah pada tanaman yang mengoverekspresikan OsHox6 akan membantu menjelaskan peranan gen OsHox6 dalam membantu tanaman padi beradaptasi terhadap cekaman kekeringan. Sejauh ini, berdasarkan fungsi ada 8 kelompok gen yang berperan dalam merespon kekeringan, yaitu protein yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies (ROS), protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan (Cushman & Bohnert 2000). Analisis microarray dapat membantu mengidentifikasi gen yang ekspresinya dipengaruhi oleh ekspresi gen OsHox6. Selanjutnya pengamatan yang lebih mendetil terhadap karakter morfologi (ukuran sel, tinggi tanaman, daya hasil, dsb), fisiologi (status air daun, konduktan stomata, potensial air daun, fotosintesa, dsb), dan biokimia (prolin, gula, asam amino, protein LEA, dsb) pada tanaman yang mengoverekspresikan OsHox6 akan membantu memperjelas peranan OsHox6 dalam merespon kekeringan.
Selanjutnya, informasi dari hasil pengamatan pada tanaman mutan yang ekspresi gen OsHox6 dihambat diperlukan agar kesimpulan mengenai fungsi gen OsHox6 lebih akurat. Akhir-akhir ini pendekatan RNAi (RNA interference juga dikenal dengan post-transcriptional gene silencing atau disingkat PTGS) umum dilakukan karena sangat efektif dalam menghambat kerja suatu gen (Matthew 2004; Small 2007). Pada beberapa gen terutama jika ada dua gen yang memiliki fungsi yang mirip pada tanaman seperti yg terjadi pada gen OsHox4 dengan OsHox20, pendekatan dengan menghilangkan satu fungsi gen sering kurang efektif dan tidak memberikan fenotipe yang jelas berbeda (Agalou et al. 2008). Hal ini dapat diatasi dengan menghilangkan fungsi beberapa gen sekaligus yang memiliki fungsi yang mirip atau sama (Zhang 2003).
79