Latar Belakang
Padi (Oryza sativa L.) merupakan komoditas strategis, makanan pokok penduduk Indonesia dan penduduk di berbagai belahan dunia terutama Asia, Timur Tengah dan Amerika Latin. Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil, karena dibandingkan dengan tanaman lain dari kelompok monokotil, padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil (430 Mb), umur relatif singkat, menyerbuk sendiri, diploid sehingga memudahkan dalam melakukan analisis genom (http://www.patentlens. net/daisy/RiceGenome/3649/3593.html
Kekeringan adalah salah satu faktor utama penghambat produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menurunkan produksi tanaman dengan menghambat pertumbuhan dan fotosintesis (Shou et al. 2004). Menurunnya produksi akibat kekeringan berdampak pada peningkatan harga produk pertanian dan
memperburuk kemiskinan
). Meskipun variasi ukuran genom dan ploidi pada tanaman monokotil sangat besar, genom padi dan tanaman monokotil lainnya sangat konservatif baik dalam hal sekuen dari gen yang ada, juga dalam urutan gen atau “synteni”. Sehingga informasi yang ada pada genom tanaman padi dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari genom tanaman monokotil lainnya.
tahun terakhir dan prediksi 50 tahun ke depan menggunakan model perubahan iklim global mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi (Naylor et al. 2007). Kekeringan dapat terjadi kapan saja selama fase pertumbuhan padi, namun yang paling merugikan adalah kekeringan yang terjadi pada fase generatif. Perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi perubahan iklim yang ekstrim. Upaya untuk mempelajari sifat toleran kekeringan pada level molekul sangat aktif dilakukan di seluruh dunia untuk membantu mengungkap mekanisme molekuler tanaman pada kondisi kekurangan air. Pemahaman ini sangat membantu upaya perakitan padi toleran kekeringan di masa mendatang.
Sifat toleran kekeringan sangat kompleks, dikendalikan oleh banyak gen (multigenik) yang tersebar di banyak lokus dan diwariskan secara kuantitatif (Valliyodan & Nguyen 2006; Fleury et al. 2010; Lang & Buu 2010). Selain itu tanaman memiliki mekanisme yang berbeda (escape, penghindaran atau avoidance, atau toleran) dalam merespon kekeringan (Levit 1972). Tanaman escape kekeringan dengan mempersingkat siklus hidupnya. Sebahagian tanaman menghindari kekeringan dengan meningkatkan penyerapan air dan meminimalkan kehilangan air. Tanaman toleran kekeringan melibatkan mekanisme osmotic adjustment, antioksidan, dan ketahanan desikasi. Namun bagaimana mekanisme molekuler tanaman dalam merespon dan beradaptasi terhadap kekeringan belum sepenuhnya dimengerti.
Berbagai pendekatan telah diupayakan untuk mempercepat pengungkapan mekanisme toleran kekeringan pada level molekuler. Sejumlah gen terinduksi kekeringan telah berhasil diidentifikasi pada level transkripsi menggunakan analisis microarray pada tanaman model Arabidopsis dan padi (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Zhou et al. 2007), namun belum semua fungsi gen berhasil diungkapkan. Analisis fungsional genomik sangat penting dilakukan untuk memahami lebih lanjut fungsi gen terkait dan bagaimana mekanisme pengaturannya pada level molekuler.
Berdasarkan pengaturan ekspresi gen, Yamaguchi-Shinozaki dan Shinozaki (1993a) mengelompokkan gen-gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan ke dalam dua kelompok utama, yaitu kelompok yang ekspresinya bergantung pada ABA (ABA dependent) dan tidak bergantung pada ABA (ABA-independen). Berdasarkan peran atau fungsi proteinnya maka Shinozaki et al. (2003) mengelompokkan gen-gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan pada dua kelompok utama, protein fungsional (seperti osmoprotektan, LEA, transporter, chaperon) dan protein regulator (misalnya faktor transkripsi dan protein kinase). Yang et al. (2010) membagi gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi biologisnya ke dalam 3 kelompok; yaitu yang berperan dalam (1) regulasi transkripsi, (2) post-transkripsi RNA atau fosforilasi protein, dan (3) metabolisme osmoprotektan atau molekul chaperon. Selain itu masih ada kelompok gen yang belum diketahui fungsinya (Bhatnagar-Mathur et al. 2008).
3
Oleh karena kompleksnya sifat toleran kekeringan, penyisipan satu gen yang memiliki fungsi tunggal tidak cukup untuk mengembalikan fungsi sel dan membuat tanaman lebih toleran kekeringan (Bohnert et al. 1995; Mitra 2001).
Untuk mengatasi hal tersebut akhir-akhir ini penelitian lebih diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan. Faktor transkripsi berperan dalam mengatur ekspresi gen-gen lain melalui pengikatan spesifik antara protein faktor transkripsi dengan elemen cis-acting promoter gen target. Sejumlah faktor transkripsi terinduksi kekeringan pada tanaman telah berhasil diungkap. Secara umum faktor transkripsi yang responsif terhadap kekeringan tersebut dikelompokkan ke dalam beberapa famili seperti AP2/ERF, bZIP, NAC, MYB, MYC, Cys2His2 zinc finger dan WRKY (Vinocur & Altman 2005; Bartels & Sunkar 2005; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 2007).
Setelah sekuen genom padi dan Arabidopsis berhasil diungkap, faktor transkripsi yang ada pada tanaman padi dan Arabidopsis dapat diidentifikasi (Seki et al. 2002; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 2007; Agalou et al. 2008). Berbagai teknik reverse genetik telah dikembangkan untuk mempelajari fungsi faktor transkripsi. Secara umum teknik reverse genetik ini dibagi ke dalam 2 pendekatan, yaitu overekspresi dan knockout (Zhang 2003). Selain itu analisis promoter yang difusikan dengan gen pelapor digunakan untuk mempelajari mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler dan aktivitas promoter secara spasial dan temporal (Hiwatashi & Fukuda 2000; Xiao & Xue 2001; Johannesson et al. 2003; Itoh et al. 2008).
HD-Zip adalah salah satu faktor transkripsi yang unik ditemukan pada tanaman, dikenali dengan adanya homeodomain yang penting untuk pengikatan DNA dan motif leucin zipper yang membantu proses dimerisasi protein. Proses dimerisasi protein diperlukan untuk membantu proses pengikatan DNA. HD-Zip merupakan suatu famili faktor transkripsi yang besar yang dibagi ke dalam IV sub-famili berdasarkan kespesifikan pengikatan DNA oleh homeodomain, struktur dan fungsi gen, dan adanya motif lain (Ariel et al. 2007). HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam. Ekspresi Gen HD-Zip sub-famili I dan II di pengaruhi faktor eksternal termasuk kekeringan dan berperan dalam adaptasi
perkembangan tanaman pada saat terjadi cekaman (Olsson et al. 2004; Dezar et al. 2005a; Agalou et al. 2008). Faktor transkripsi HD-Zip di tanaman padi baru diteliti beberapa tahun belakangan ini. Informasi tentang fungsi dan mekanisme regulasinya masih sangat terbatas. Dari 31 gen HD-Zip sub-famili I,II, dan III yang ada pada padi, baru 2 yang dipelajari fungsinya, yaitu OsHox1 dan OsHox4. OsHox1 berperan dalam differensiasi jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000), sedangkan OsHox4 berperan dalam pemanjangan dan pembesaran sel pembuluh (Agalou et al. 2008).
Pada penelitian ini fungsi gen faktor transkripsi OsHox6 yang diisolasi dari tanaman padi dipelajari. Gen OsHox6, merupakan anggota HD-Zip sub-famili I, dilaporkan meningkat ekspresinya pada saat kekeringan (Purwantomo 2007; Agalou et al. 2008), sehingga diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Untuk mempelajari lebih lanjut fungsi gen OsHox6 dalam adaptasi toleran kekeringan, aktivitas native promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus diamati pada tanaman padi saat kekeringan. Kekeringan meningkatkan ekspresi gen OsHox6 pada berbagai organ (batang, akar, daun, dan bunga) tanaman padi, namun ekspresinya rendah. Oleh karena itu pada percobaan tahap berikutnya dilakukan penambahan jumlah salinan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6 padi pada kondisi kekeringan. Sebelumnya, Xiao et al. (2007) melaporkan bahwa OsLEA3 menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekurangan air. Selanjutnya toleransi tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi.
Selanjutnya untuk mendukung kegiatan analisis fungsi gen, pengembangan teknik transformasi menggunakan Rhizobium sebagai upaya untuk menyediakan teknik transformasi alternatif untuk tanaman khususnya padi akan di pelajari. Teknik yang umum digunakan saat ini untuk mengintroduksi gen pada tanaman, khususnya padi, adalah menggunakan transformasi Agrobacterium. Teknik ini memiliki keunggulan dimana kemungkinan untuk menghasilkan satu salinan gen lebih besar dan dapat digunakan untuk mentransformasi berbagai tanaman termasuk dari kelompok dikotil dan monokotil. Namun, teknik ini telah
5
dipatenkan yang mana dapat menjadi ganjalan bila produk akan dipasarkan. Oleh karena itu perlu diupayakan teknik transformasi alternatif.
Broothaerts et al. (2005) melaporkan bahwa sejumlah bakteri yang berasosiasi dengan tumbuhan, jika dilengkapi dengan gen-gen virulen dan T-DNA dari plasmid Ti mampu mentransfer T-DNA ke dalam genom tanaman. Bakteri Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp dan Mesorhizobium loti mengandung plasmid Ti dari Agrobacterium dapat mentransfer T-DNA ke dalam genom padi, tembakau dan Arabidopsis dengan efisiensi transformasi yang bervariasi antara 1-40% tergantung pada spesies dan pengujian yang digunakan. Evaluasi efektititas bakteri selain Agrobacterium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman dibandingkan dengan A. tumefaciens belum pernah dilakukan. Informasi ini penting sebagai langkah awal dalam upaya pengembangan transformasi genetik menggunakan bakteri selain Agrobacterium. Selanjutnya perubahan faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi diharapkan dapat meningkatkan efisiensi transformasi di masa mendatang.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk;
1. Mengevaluasi efektifitas sistem transformasi Rhizobium pada tanaman padi dibandingkan dengan sistem transformasi Agrobacterium,
2. Menjelaskan regulasi gen OsHox6 melalui studi bioinformatik promoter gen OsHox6 serta analisis pola ekspresinya pada tanaman padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen penyandi β-glucuronidase, dan
3. Menjelaskan peranan faktor transkripsi OsHox6 pada tanaman transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 pada kondisi kekeringan.
Manfaat Penelitian
1. Teknik transformasi alternatif perlu ada selain untuk menghindari kendala paten juga untuk meningkatkan efisiensi transformasi tanaman yang sulit di transformasi dengan Agrobacterium.
2. Informasi tentang peranan gen OsHox6 dalam mekanisme toleran kekeringan tanaman padi penting untuk diketahui dalam upaya mencari gen-gen potensial untuk toleran kekeringan.
3. Promoter terinduksi kekeringan dapat digunakan untuk mengendalikan ekspresi gen-gen penting terkait toleran kekeringan.
4. Padi toleran kekeringan sangat diperlukan untuk antisipasi fluktuasi iklim ekstrim (kemarau panjang) yang semakin sering terjadi akibat pemanasan global yang mengakibatkan gagal panen di daerah utama padi sawah yang rawan kekeringan.
Ruang Lingkup Penelitian
Untuk mencapai tujuan penelitian di atas, maka penelitian ini dibagi dalam 3 tahap percobaan. Pada tahap awal dilakukan penelitian pendahuluan dengan topik “Analisis komparatif transformasi genetik padi menggunakan Agrobacterium tumefaciens dan Rhizobium leguminosarum”. Untuk mengevaluasi keefektifan teknik transformasi Rhizobium dibandingkan dengan transformasi Agrobacterium pada tanaman padi, maka pengamatan difokuskan pada efisiensi regenerasi dan transformasi masing-masing sistem, ekspresi gen, kecenderungan jumlah salinan gen, pola pewarisan gen, dan pertumbuhan dan kesuburan (fertilitas) tanaman yang dihasilkan oleh kedua sistem transformasi ini. Pada tahap berikutnya dilakukan isolasi dan konstruksi vektor yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus. Selanjutnya vector ini ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi. Aktivitas promoter OsHox6 diamati pada tanaman padi yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus pada kondisi air terbatas (kekeringan) atau tidak kekurangan air (normal). Selanjutnya, pengamatan dilakukan pada organ vegetatif (batang, akar, daun) dan generatif (bunga). Untuk mengamati jaringan yang mengakumulasikan GUSPlus dilakukan irisan secara melintang dan membujur.
Percobaan tahap berikutnya dilakukan penambahan jumlah salinan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6 pada kondisi kekeringan. Selanjutnya
7
ketahanan tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi. Seluruh kegiatan penelitian dalam disertasi ini dirangkum dalam alur penelitian yang disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Diagram alur penelitian
Pembentukan populasi tanaman
mengandung OsHox6P:: GUSPlus
Pembentukan populasi tanaman
mengandung OsLEA3P:: OsHox6
Isolasi Promoter OsHox6 dan
konstruksi vektor pCAMBIA1305.1
OsHox6P::GUSPlus
Studi transformasi padi Ciherang, Rojolele dan
Nipponbare dengan
Rhizobium dan
Agrobacterium
Evaluasi efektifitas transformasi
Analisis ekspresi gen yang
dikendalikan oleh promoter OsHox6
Evaluasi tingkat toleransi tanaman padi mengandung ekstra gen