Establishment Genotipe of Salinity Tolerant Rice Varieties Ciherang, Inpari 13 and Inpara 3
Abstrak
Mutasi induksi dikombinasikan dengan seleksi in vitro dapat digunakan untuk merakit varietas padi toleran salinitas. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan nomor-nomor mutan somaklon padi toleran salinitas hasil mutasi induksi dan seleksi in vitro. Varietas yang digunakan adalah Ciherang, Inpari 13, Inpara 3. Penelitian ini terdiri 4 kegiatan utama yaitu induksi kalus embriogenik, induksi mutasi dan seleksi in vitro, regenerasi tunas, aklimatisasi. Hasil dari penelitian adalah diperoleh 29 nomor putatif mutan somaklon yang berasal dari padi varietas Ciherang. 39 nomor putatif mutan somaklon yang berasal dari padi varietas Inpari 13 dan 42 nomor putatif mutan somaklon yang berasal dari padi varietas Inpari 13.
Kata kunci : seleksi in vitro, mutasi, mutan, Oryza sativa L
Abstract
Induced mutation combined with in vitro selection can be used to assemble the salinity tolerant rice varieties. The purpose of this study is to get the numbers putative mutant somaclone salinity tolerant rice by induced mutation and in vitro selection. The varieties used are Ciherang, Inpari 13, Inpara 3. This study comprises four main activities: embryogenic callus induction, induced of mutation and in vitro selection, shoot regeneration, acclimatization. Results of the study were 29 putative mutants somaclone numbers derived from rice varieties Ciherang 39 numbers from Inpari 13 and 42 number from Inpara 3.
Key word: In vitro selection, mutation, mutan, Oryza sativa L
Pendahuluan
Padi merupakan komoditas penting yang kebutuhannya terus meningkat seiring dengan bertambahnya jumlah penduduk. Alih fungsi lahan kesektor non pertanian merupakan salah satu faktor penyebab terhambatnya peningkatan produksi padi. Pemanfaatan lahan marginal dengan kondisi salin merupakan salah satu upaya yang dapat dilakukan peningkatan produksi padi. Untuk itu dibutuhkan varietas padi yang dapat dikembangkan pada kondisi salin dan memiliki produktifitas tinggi.
Penggunaan teknik kultur jaringan yang dikombinasi dengan mutasi induksi dapat mengasilkan variasi somaklonal sebagai keragamman genetik tanaman. Variasi tersebut dapat berasal dari keragamman yang terjadi dalam kultur atau dampak mutasi induksi yang mengubah satu atau beberapa sifat dengan tetap mempertahankan karakter lainnya yang sudah dimiliki oleh tanaman induk (Yunita 2009).
Keragamman genetik yang ditimbulkan oleh mutasi induksi bersifat acak. Untuk mengidentifikasi keragamman somaklonal maupun induksi mutasi ke arah perubahan yang diinginkan, dapat digunakan teknik seleksi invitro. Pada metode
tersebut, seleksi ketahanan terhadap cekaman abiotik seperti salinitas dapat digabungkan dalam media kultur in vitro dan digunakan untuk menumbuhkan varian somaklon yang diperoleh. Tanaman hasil regenerasi populasi sel somatik pada kultur in vitro kemungkinan akan mempunyai sifat genetik yang toleran terhadap komponen seleksi. Seleksi in vitro lebih efisien karena kondisi seleksi dapat dibuat homogen, tempat yang dibutuhkan relatif sedikit, dan efektivitas seleksi tinggi. Oleh karena itu, kombinasi antara mutasi induksi dan seleksi in vitro merupakan alternatif teknologi yang efektif dalam menghasilkan individu dengan karakter yang spesifik (Biswan et al. 2002).
Seleksi in vitro untuk mendapatkan varian yang toleran terhadap salinitas dapat menggunakan agen seleksi berupa senyawa kimia yang memiliki sifat yang hampir sama dengan komdisi di alam. Untuk cekaman salinitas umumnya mengunakan agen seleksi NaCl. Respon pertumbuhan kalus padi yang dikulturkan pada medium yang mengandung NaCl yang lebih tinggi, lebih terhambat dari pada kalus padi yang dikulturkan pada media yang mengandung NaCl yang lebih rendah. Penurunan pertumbuhan kalus dalam lingkungan yang mengandung NaCl disebabkan oleh pengalihan beberapa kuantum energi untuk pertumbuhan dan metabolisme (Pushpam & Sree Rangaswamy 2000; Basu et al. 2002). Metode tersebut juga telah diterapkan pada tanaman padi dimana kalus embriogenik padi yang telah diradiasi sinar gamma mampu beregenerasi membentuk tunas pada media seleksi yang mengandung NaCl dalam konsentrasi tinggi (Salaem et al. 2005, Sankar et al. 2009).
Tujuan Peneltian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan nomor-nomor mutan somaklon padi toleran salinitas hasil mutasi induksi dan seleksi in vitro.
Metode Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah embirio zigotik dari benih varietas Ciherang, Inpari 13, Inpara 3, Pokkali dan IR29. Penelitian ini terdiri 4 kegiatan utama yaitu induksi kalus embriogenik, induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro kalus, regenerasi kalus hasil seleksi, aklimatisasi plantlet putatif mutan somaklon.
Induksi Kalus Embriogenik
Eksplan yang digunakan adalah embrio zigotik diisolasi dari biji yang sudah matang. Biji disterilisasi dalam laminar flow menggunakan bahan-bahan sterilan, antara lain alkohol dan klorok. Selanjutnya embrio ditanam pada media yang terbaik yang diperoleh pada kegiatan studi regenerasi kalus. Untuk padi varietas Ciherang, Inpari 13 dan Inpara 3 menggunakan MS +2,4-D 3 mg/l + Chasein hidrolisat 3 g/l, sedangkan Inpara 3 dan IR 29 adalah MS +2,4-D 5 mg/l + Chasein hidrolisat 3 g/l dalam satu botol ditanam 10 eksplan. Botol yang telah ditanami eksplan selanjutnya diinkubasi di rak kultur dalam keadaan gelap dengan ditutup menggunakan kain berwarna hitam. Temperatur ruangan diatur menjadi 24 - 25oC. Peubah yang diamati adalah persentase pembentukan kalus yang terbentuk dan persentase kalus embriogenik (jumlah kalus embriogenik/jumlah
kalus yang terbentuk x 100%). Induksi kalus dilakukan berulang kali agar diperoleh kalus embrionik dalam jumlah banyak.
Induksi Mutasi dengan Iradiasi Sinar Gamma dan Seleksi In Vitro Kalus
Kalus embriogenik yang terbentuk diberi perlakuan iradiasi. Dosis iradiasi sinar gamma yang diberikan sebesar nilai LD50, nilainya telah diperoleh pada kegiatan sebelumnya yaitu untuk varietas Ciherang adalah 22,468 Gy, Inpari 13 adalah 23,124 Gy dan Inpara 3 adalah 21,0305 Gy Kalus yang sudah diberi perlakuan mutasi selanjutnya dipindah ke media yang sama untuk induksi kalus selama 4 hari. Kalus yang telah diberi perlakuan mutasi dengan iradiasi sinar gamma, dipindah kemedia proliferasi kalus, ditambahkan NaCl (BM 58,45) sebanyak nilai LC50 yaitu 85,79 mM untuk varietas Ciherang, 90,91 mM untuk varietas Inpari 13, 91,77 mM untuk varietas Inpara 3, 103,37 mM untuk varietas Pokkali dan 70,67mM untuk varietas IR 29. Kalus dari media seleksi setelah 2 minggu disub kultur pada media yang sama dengan kandungan NaCl yang sama selama 2 minggu. Seleksi dilakukan selama 2 periode dan masing-masing periode selama 2 minggu. Peubah yang diamati adalah jumlah kalus yang menjadi coklat.
Regenerasi Kalus Hasil Seleksi
Kalus yang masih tetap hidup pada media seleksi dipindahkan kemedia untuk regenerasi tunas yaitu MS + BA 3 mg/l + Zeatin 0,3 mg/l + Prolin 100 mg/l untuk kalus padi varietas Ciherang, Inpari 13 dan Inpara 3 dan MS + BA 3 mg/l + Zeatin 0,1 mg/l + Prolin 100 mg/l untuk padi varietas Inpara 3 dan Pokkali. Peubah yang diamati adalah persen kalus yang beregenerasi membentuk plantlet utuh pada tiap varietas padi yang digunakan.
Aklimatisasi Plantlet Putatif Mutan Somaklon
Plantlet yang dihasilkan diaklimatisasi dengan cara plantlet yang dihasilkan dikeluarkan dari media agar dan dikulturkan pada media air biasa pada suhu ruang. Setelah satu minggu plantlet dipindahkan ke media Yosida hingga terbentuknya akar baru. Selanjutnya plantlet ditanam pada media lumpur. Peubah yang diamati adalah persen plantlet yang hidup pada setiap varietas padi.
Hasil dan Pembahasan Induksi Kalus Embriogenik
Pada umumnya embrio zigotik mulai membengkak satu minggu setelah tanam dan menghasilkan kecambah pada bagian pangkal. Kalus yang terbentuk umumnya bersifat embriogenik yaitu dengan ciri-ciri warna putih kekuningan, mengkilat dan remah (Gambar 8).
Tabel 11. Persen kalus dan kalus embriogenik padi yang terbentuk dari eksplan embrio zigotik dewasa
Varietas Jumlah eksplant
Persentase kalus terbentuk Persentase kalus embriogenik Ciherang 500 99,0 98,2 Inpari 13 500 96,0 97,4 Inpara 3 500 97,4 93,0 Pokalli 500 100,0 90,6 IR 29 500 99,6 95,6
Gambar 8. Kalus embriogenik dari embrio zigotik padi varietas (a) Ciherang (b) Inpari 13 dan (c) Inpara 3
Kemampuan masing-masing varietas padi dalam membentuk kalus cukup beragam. Pada varietas Ciherang eksplan yang membentuk kalus sebesar 99% dengan 98% kalus yang bersifat embriogenik. Pada varietas Inpari 13 persentase kalus yang terbentuk dari embriosigotik adalah 96% dengan 97,4% kalus diantaranya bersifat embriogenik. Untuk varietas Inpara 3, 974 % eksplan mampu membentuk kalus dan yang bersifat embriogenik sebesar 93%. Pokkali merupakan padi yang cukup respon dimana 100% eksplan mebnetuk kalus dengan 90,6 kalus bersifat embriogenik. Pada varietas IR 29, eksplan yang mampu membentuk kalus sebesar 99,6% dengan 95,6% kalus bersifat embriogenik. Keragaan kalus secara visual menunjukkan kelima varietas tersebut menghasilkan kalus yang remah (friabel), berwarna bening, dan terbentuk nodul. Hal ini menunjukkan bahwa kalus yang diperoleh akan dapat diregenerasikan menjadi plantlet. Banyak faktor yang menentukan kemampuan eksplan untuk membentuk kalus salah satu diantaranya adalah varietas. Untuk varietas berbeda memiliki respon yang berbeda terhadap kemampuan eksplan membentuk kalus walaupun dikulturkan pada media yang sama.
Induksi Mutasi Dengan Iradiasi Sinar Gamma dan Seleksi In Vitro
Kalus yang bersifat embriogenik dikulturkan pada media MS dan selanjutnya diradiasi dengan sesuai dengan LD50. Setelah diiradiasi kalus dipindahkan pada media induksi kalus yang bertujuan untuk recovery, memulihkan kondisi kalus dan mendeteksi adanya kontaminasi.
Setelah 4 hari, kalus disubkultur pada media seleksi, empat hari pada media seleksi kalus terlihat mulai mencoklat, strukturnya yang menjadi
lembek. Hal ini menujukkan sel-sel kalus mulai mengalami kerusakan akibat cekaman radiasi dan seleksi.
Tabel 12. Seleksi in vitro kalus mutan padi pada media yang mengandung NaCl dengan konsentrasi LC50
Varietas Jumlah kalus embriogenik Jumlah kalus menjadi coklat persentase kalus menjadi coklat Ciherang 450 196 43,56 Inpari 13 450 220 48,89 Inpara 3 450 215 47,78
Gambar 9. Respon kalus padi akibat pemberian Iradiasi sinar gamma dan seleksi pada media NaCl (a) Ciherang, (b) Inpari 13, (c) Inpara 3
Respon kalus dari masing masing varietas terhadap garam cukup beragam. Pada varietas Ciherang persentase kalus yang mencoklat sebesar 43,56%, Varietas Inpari 13 sebesar 48,89% dan untuk kalus Inpara 3 sebesar 47,78%. Pessarakli (1991) menyatakan bahwa adanya cekaman salinitas dengan konsentrasi tertentu dapat menyebabkan penyerapan hara dan pengambilan air terhalang sehingga menyebabkan pertumbuhan abnormal atau lambat. Babu et al. (2007) menyatakan bahwa sel yang terpapar oleh cekaman salinitas (NaCl) akan menghabiskan lebih banyak energi untuk melakukan metabolismenya, sehingga energi yang dihasilkan lebih banyak digunakan untuk mengatur penyesuaian osmotik sehingga berdapak pada pertumbuhan sel somatik yang tidak normal.
Regenerasi Kalus Hasil Seleksi Membentuk Plantlet
Setelah 4 minggu pada media seleksi kalus disubkultur kemedia regenerasi. Setelah 6 minggu pada media regenerasi, mulai terjadi perubahan penanpilan kalus hasil seleksi yaitu, mulai terlihat adanya spot-spot hijau yang masih sangat sedikit. Pengammatan pada minggu ke sepuluh terlihat bahwa pada umumnya sudah membentuk kalus nodular dan spot- spot hijau bahkan tunas adventif.
Tabel 13. Regenerasi kalus padi hasil seleksi membentuk spot hijau dan tunas adventif Varietas Jumlah eksplant Jumlah kalus membentuk spot hijau Rerata jumlah spot hijau Kalus membentuk tunas adventif Rerata jumlah tunas adventif per klam kalus Ciherang 450 124 5 83 2,3 Inpari 13 450 123 6 80 1,3 Inpara 3 450 132 5 87 1,4 Pokalli 200 98 3 45 1,6 IR 29 200 99 4 34 1,7
Pada Tabel 13 dapat diketahui bahwa dari 450 kalus embriogenik varietas Ciherang yang dikulturkan pada media regenerasi, 83 kalus yang mampu membentuk tunas adventif dengan rerata jumlah tunas adalah 2,3. Pada kalus padi varietas Inpari 13, jumlah kalus yang mampu mebentuk tunas adalah 80 dengan rerata jumlah tunas adventif 1,3, sedangkan kalus padi asal varietas Inpara 3 jumlah kalus yang membentuk tunas adventif adalah 87 dengan rerata jumlah tunas adventif 1,4. Jumlah kalus padi asal varietas Pokkali dan IR 29 yang disubkultur pada media regenerasi adalah 200 kalus. Pada varietas Pokkali, 45 kalus yang dapat membentuk tunas adventif dengan rerata sebesar 1,6, sedangkan varietas IR 29 jumlah kalus yang mampu membentuk tunas advebtif sebesar 34 kalus.
Aklimatisasi Plantlet Putatif Mutan Somaklon
Aklimatisasi merupakan tahap yang penting terutama pada tanaman hasil keragamman somaklonal, karena pada umumnya plantlet yang berasal dari keragamman somaklonal dan seleksi in vitro akarnya memiliki struktur yang berbeda-beda sehingga kemampuan pada saat adaptasi pada saat aklimatisasi tidak sama. Persentase keberhasilan aklimatisasi umumnya sangat rendah, sehingga perlakuan dan kondisi lingkungan saat aklimatisasi sangat menentukan keberhasilan aklimatisasi. Untuk menyesuaikan dengan kondisi lingkungan baru pada saat aklimatisasi dilakukan dalam tiga tahap yaitu plantlet dikulturkan pada air bebas ion selama seminggu kemudian dipindahkan larutan yosida dan setelah tunas mampu mengembangkan akar, baru plantlet dipindahkan ke media lumpur (Gambar 10).
Tabel 14. Aklimatisasi plantlet putatif mutan somaklon padi hasil seleksi in vitro
Varietas Jumlah plantlet yang diaklimatisasi
Jumlah tanaman yang hidup
Ciherang 50 29
Inpari 13 50 39
Inpara 3 50 42
IR 29 20 16
Gambar 10. Proses aklimatisasi nomor-nomor putatif mutan somaklon padi (a) Plantlet di kultur pada media aquades, (b) Plantlet dikultur pada media yosida (c) Plantlet di kultur pada media lumpur
Pada tabel diatas dapat diamati bahwa 50 plantlet yang berasal dari padi varietas Inpara 3 memiliki jumlah plantlet hidup yang paling banyak yaitu sebesar 42 selanjutnya dari 50 plantlet yang di aklimatisasi, diikuti dengan Inpari 13 dan Inpara 3. Untuk varietas IR 29 dan Pokkali dari 20 plantlet diaklimatisasi, yang dapat tumbuh adalah berturut-turut adala 16 dan 12.
Simpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan diperoleh 29 nomor putatif mutan somaklon yang berasal dari padi varietas Ciherang. 39 nomor putatif mutan somaklon yang berasal dari padi varietas Inpari 13 dan 42 nomor putatif mutan somaklon yang berasal dari padi varietas Inpara 3. Untuk IR 29 dan Pokkali adalah 16 dan 12.