Determination of The LC50 Value of NaCl on Some Varieties of Eice Callus
Abstrak
Pengaruh NaCl terhadap pertumbuhan kalus padi tergantung pada konsentrasi NaCl dan varietas. Konsentrasi letal merupakan salah satu faktor yang menunjukkan tingkat sensitivitas populasi sel somaklon (kalus) karena efek racun dari NaCl. Dengan konsentrasi NaCl yang tinggi dapat menurunkan pertumbuhan kalus, konsentrasi rendah merangsang sel somatik untuk melakukan mekanisme fisiologi toleransi untuk tetap hidup. Pengaruh NaCl diukur berdasarkan nilai LC (konsentrasi letal). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui nilai LC50 NaCl, melihat pengaruh NaCl terhadap pertumbuhan kalus padi dan regenerasi kalus membentuk plantlet. Bahan tanaman yang digunakan adalah embrio zigotik dewasa padi Ciherang, Inpari 13, Inpara, Pokkali dan IR 29. Perlakuannya yang diberikan yaitu konsentrasi NaCl (0, 50, 100, 150 dan 200 mM). Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan dengan 5 clamp kalus embriogenik per botol. Hasil penelitian menunjukkan nilai LC50 NaCl Ciherang adalah 85,78, Inpari 13 adalah 90,9, Inpara 3 adalah 91,77, IR29 adalah 70,67 dan Pokkali 103,37. Meningkatnya konsentrasi NaCl mengakibatkan persentase kalus mencoklat meningkat, pertumbuhan kalus terhambat dan penurunan kemampuan regenerasi kalus membentuk tunas adventif.
Kata Kunci: seleksi in vitro, toleran garam,Oryza sativa L.
Abstract
Effect of NaCl on the growth of rice callus depends on the concentration of NaCl and variety. Lethal concentration is one factor that shows the level of sensitivity of cells (callus) of the poison effect of NaCl. High concentration of NaCl can decrease growth of the callus; low concentrations stimulate the cells to form tolerance mechanisms in order to survive. Effect of NaCl measured based on the value of LC (lethal concentration). This study aims to determine the LC50 values of NaCl, studied it’s effect on the growth of rice callus and regeneration of the plantlets. The plant material used were mature embryo of rice Ciherang, Inpari 13, Inpara, Pokkali and IR 29. The treatment is concentrations of NaCl (0, 50, 100, 150 and 200 mM). Each treatment consisted of 10 replicates with 5 embryogenic calluses per bottle. The results showed the NaCl LC50 value Ciherang is 85,78 , Inpari 13 is 90.91, Inpara 3 is 91,77, IR29 is 70,67. The increasing of NaCl concentration makes the percentage of callus browning increased, inhibited callus growth and decreased ability callus regenerate.
Key Word :in vitro selection, salt tolerant, Oryza sativa L
Pendahuluan
Padi merupakan tanaman pangan yang sangat penting dan hampir setengah dari populasi dunia mengkonsumsi beras (Khush & Virk 2000). Berdasarkan nilai ekonomi dari tanaman, padi menduduki nilai tertinggi dibandingkan dengan
tanaman bahan makan pokok lainnya (jagung, gandum, kentang, singkong, dan gandum), sedangkan berdasarkan jumlah produksi, padi menempati urutan kedua setelah jagung (FAOSTAT 2009). Di Indonesia, komoditas padi menempati urutan pertama dari tujuh komoditas pangan utama baik dari segi produksi dan nilai ekonomi. Permintaan padi terus meningkat sejalan dengan meningkatnya jumlah penduduk. Penggunaan lahan marginal seperti tanah salin adalah salah satu cara untuk meningkatkan produksi padi.
Salinitas adalah cekaman abiotik yang mempengaruhi aktivitas metabolisme pada tanaman. Cekaman kekeringan dan garam adalah beberapa cekaman abiotik yang mengurangi produktivitas tanaman. Pada kondisi salin, produksi padi dapat menurun lebih dari 50 %. Salinitas menyebabkan produksi tanaman berkurang dan tanaman menjadi mati (Tan & Lang 2003, Mahajan & Tutejan 2005, Roychoudury 2008, Nishimura et al. 2011, Rany et al. 2012).
Salinitas dapat menurunkan pertumbuhan tanaman melalui efek osmotik dan toksik, efek osmotik dapat mengurangi kemampuan tanaman untuk mengambil air dan efek toksik dapat menyebabkan penuaan dini dan mengurangi kemampuan fotosintesis tanaman (Munns 2002, Munns & Tester 2008, Nemati et al. 2011, Horie et al. 2012). Dampak jangka panjang dari salinitas adalah tanaman mengalami stres ion, yang dapat menyebabkan penuaan dini daun dewasa (Shereen et al. 2005).
Kultur in vitro merupakan metode yang dapat digunakan untuk mengetahui respon tanaman terhadap kondisi salinitas dan menyeleksi tanaman toleran (Vijayan et al. 2003). Seleksi kalus padi pada media yang mengandung garam dan regenerasinya membentuk tunas telah banyak dilaporkan (Hwe et al
2011, Zinnah et al. 2013) Metode ini dapat menjadi cara alternatif untuk seleksi pada pemuliaan tanaman konvensional karena dapat menyaring mutan dalam waktu yang cepat. Seleksi in vitro menggunakan NaCl merupakan salah satu pendekatan untuk menyeleksi sel-sel yang toleran garam. Studi tentang seleksi in vitro mengunakan NaCl untuk mendapatkan tanaman toleran salinitas dapat digunakan untuk menjelaskan aspek-aspek fisiologis mengenai toleransi terhadap faktor abiotik antara lain salinitas.
Agen selektif (NaCl) telah diterapkan dalam banyak penelitian untuk menyeleksi kalus atau kultur suspensi. Dalam beberapa penelitian digunakan eksplan berupa kalus, embrio atau plantlet yang diregenerasikan pada kondisi salin (Sharry & Silva 2006). Sensitivitas masing-masing varietas terhadap garam sangat bervariasi, pertumbuhan kalus pada kondisi garam tergantung pada genotipe dan konsentrasi NaCl (Gandonou et al. 2005, Htwe et al. 2011)
Sampai saat ini informasi tentang pengaruh NaCl terhadap pertumbuhan dan regenerasi kalus padi varietas Ciherang, Inpari 13. Inpara 3, Pokkali Dan IR 29 belum banyak dilakukan dan dipublikasikan .
Tujuan penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan nilai LC50 NaCl kalus padi, untuk mempelajari pengaruh NaCl pada pertumbuhan kalus padi serta regenerasinya membentuk plantlet.
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah embirio zigotik dari benih varietas Ciherang, Inpari 13, Inpara 3, Pokkali dan IR 29.
Pengaruh NaCl Terhadap Pencoklatan Kalus dan Penentuan Nilai LC50 Kalus primer yang berumur 4 minggu setelah tanaman diinduksi dari embrio dewasa yang dikulturkan pada media MS yang mengandung NaCl yang terdiri dari beberapa taraf konsentasi yaitu 0, 50 mM, 100 mM, 150 mM, dan 200 mM, masing-masing perlakuan terdiri atas 5 ulangan, masing-masing ulangan terdiri atas 10 eksplant. Peubah yang diamati adalah jumlah kalus yang mati (berwarna coklat kehitaman) dan kalus yang tetap tumbuh warna putih kekuningan dan perubahan berat kalus. Data dianalisa untuk menentukan letal konsentrasi. Penentuan LC50, menggunakan best curvit analisis untuk mendapatkan persamaan yang terbaik. Lamanya inkubasi kalus dalam media seleksi yang mengandung NaCl adalah 4 minggu. Setiap 2 minggu dilakukan subkultur.
Pengaruh NaCl Terhadap Regenerasi Kalus
Setelah diseleksi selanjutnya kalus dipindahkan kemedia regenerasi untuk melihat kemampuan kalus beregenerasi setelah diseleksi. Media regenerasi yang digunakan untuk varietas Ciherang, Inpari 13 dan Pokkali adalah MS + BA 3 mg/l + Zeatin 0,3 mg/l + prolin 100 mg/l, sedangkan untuk Inpara 3 dan IR 29 adalah MS + BA 3 mg/l + Zeatin 0,1 mg/l + prolin 100 mg/l. Pada penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap. Perlakuan yang dicobakan adalah 5 taraf dosis NaCl (0, 50 mM, 100 mM, 150 mM, dan 200 mM). Masing-masing perlakuan terdiri atas 5 ulangan, masing-masing ulangan terdiri atas 10 eksplan. Peubah yang dimati adalah jumlah spot hijau perkalus, persen kalus membentuk spot hijau, persen kalus membentuk tunas dan jumlah tunas perkalus.
Hasil dan Pembahasan
Pengaruh NaCl Terhadap Pencoklatan Kalus dan Penentuan Nilai LC50 Pada Tabel 8. dapat diamati peningkatan konsentrasi garam yang diberikan akan mengakibatkan peningkatan jumlah kalus yang mencoklat.
Table 8. Persentase kalus mencoklat pada media yang mengandung NaCl dengan konsentrasi berbeda Konsentrasi NaCl (mM) Varietas Ciherang (%) Inpari 13 (%) Inpara 3 (%) Pokalli (%) IR 29 (%) 0 0 0 0 0 0 50 48 42 46 12 78 100 74 68 64 58 84 150 78 72 70 62 98 200 100 100 100 100 100
Pada Tabel 8. Dapat terlihat bahwa peningkatan konsentrasi NaCl mengakibatkan peningkatkan persentase kalus mencoklat. Untuk kalus padi Ciherang, Inpari 13 dan Inpara, pemberian 50 mM NaCl pada media kultur menghasilkan kalus yang mencoklat lebih dari 40%. Pada padi varietas Pokkali (kontrol tahan) hanya 12% sedangkan IR29 (kontrol sensitif) 78%. Peningkatan konsentrasi NaCl sampai 150 mM membuat kalus mencoklat lebih tinggi dari 70%. Pada umumnya pengaruh NaCl terhadap pencoklatan kalus pada padi varietas Ciherang, Inpari 13 dan Inpara 3 tidak berbeda, kondisi tersebut menunjukkan bahwa NaCl memiliki efek penghambatan terhadap pertumbuhan kalus. Dengan meningkatnya konsentrasi NaCl menunjukkan bahwa ketidak mampuan sel-sel somatik maupun jaringan tanaman untuk menyesuaikan dengan kenaikan konsentrasi NaCl disebabkan karena adanya cekaman osmotik atau ionik (Shanthi et al, 2010).
Hasil analisis program best-fit curve analysis untuk menentukan letal konsentrasi 50 (LC50), persamaan model terbaik diperoleh didasarkan pada jumlah kalus mencoklat dapat dilihat pada Tabel 9. Berdasarkan nilai LC50 NaCl dapat dilihat setiap tingkat kepekaan varietas terhadap NaCl.
Table 9. Nilai lethal konsentrasi 50 (LC50) beberapa kalus varietas padi
Pada Tabel 9. menunjukkan masing-masing varietas memiliki sensitivitas yang berbeda terhadap NaCl. Varietas Pokkali memiliki nilai LC50 tertinggi diikuti oleh Ciherang (85,79 mM), Inpari 13 (90,91 mM), Inpara 3 (91,77 mM) dan IR29 (70,67 mM). Hal ini menunjukkan varietas Pokkali lebih toleran terhadap garam dan IR 29 lebih rentan. Oleh karena itu varietas tersebut digunakan sebagai kontrol toleran dan kontrol sensitif. Hasil ini relevan dengan penelitian Shanthi et al. (2010) dimana kalus dari varietas Pokkali dapat tumbuh lebih baik dalam medium yang mengandung garam dari pada varietas IR29.
Pengaruh Garam Terhadap Perubahan Bobot Basah Kalus
Peningkatan konsentrasi NaCl pada media mempengaruhi terhadap perubahan bobot basah kalus pada setiap minggu. Pada Gambar 7 dapat diamati bahwa peningkatan konsentrasi NaCl akan menurunkan perubahan berat basah kalus. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan NaCl dalam medium akan menurunkan kemampuan kalus untuk tumbuh.
Varietas Nilai LC50 (mM) Ciherang 85,79 Inpari 13 90,91 Inpara 3 91,77 Pokkali 103,37 IR 29 70,67
Gambar 7. Perubahan bobot basah kalus akibat perlakuan NaCl pada padi varietas (a) Ciherang , (b) Inpari 13, (c) Inpara 3, (d) Pokkali dan (e) IR 29
Gambar 7 menunjukkan varietas Inpari 13, Inpara 3 dan Pokkali pemberian sebanyak 50 mM NaCl mengakibatkan penurunan perubahan bobot basah kalus. Peningkatan konsentrasi NaCl menjadi 100-200 mM mengakibatkan perubahan bobot basah kalus untuk ketiga varietas yang tidak terlalu berbeda. Hal ini relevan dengan hasil penelitian Roa & Ratil (2012), peningkatan kandungan
a b
c d
NaCl menjadi 200 mM pada kalus yang toleran pertumbuhan pada awalnya akan tetap dan terus meningkat setelah beberapa periode kultur Respon serupa dilaporkan pada tanaman kentang toleran garam (Queiros et al. 2007) dan di Krisan sp. (Hossain et al. 2009) Penurunan perubahan bobot basah kalus merupakan fenomena umum dalam sel yang ditumbuhkan pada medium mengandung NaCl (Venkataiah et al. 2004, Roa & Patil 2012) hal ini disebabkan karena energi untuk metabolisme jaringan disalurkan untuk melawan stres.
Pada kalus padi varietas Ciherang dan IR 29, media yang mengandung 100 mM NaCl menyebabkan perubahan bobot basah kalus yang sangat rendah dibandingkan dengan penambahan 50 mM NaCl. Ada penurunan perubahan berat kalus, pada konsentrasi NaCl yang lebih tinggi, karena kalus yang mengalami cekaman salinitas seperti ketidak seimbangan air dan penyerapan nutrisi, metabolisme menjadi tergangu karean ketidak seimbangan ion dan efek osmotik. Semua faktor tersebut menyebabkan kalus memerlukan lebih banyak energi untuk metabolisme sehingga terjadi penurunan pertumbuhan. Babu et al. (2007), menyatakan bahwa sel-sel yang terkena stres salinitas (NaCl) akan menghabiskan lebih banyak energi pada metabolisme dibandingkan dengan sel tanpa cekaman salinitas (NaCl) karena energi yang dihasilkan sebagian besar digunakan untuk penyesuaian osmotik dan menyebabkan penurunan massa sel dan berdampak pada penurunan rata-rata massa sel pada konsentrasi NaCl yang lebih tinggi.
Pengaruh Garam Terhadap Regenerasi Kalus
Percobaan regenerasi dilakukan untuk memelihat kemampuan kalus untuk menginduksi tunas dalam kondisi cekaman NaCl. Ada peningkatan konsentrasi NaCl dalam medium mengakibatkan penurunan kemampuan kalus dalam meregenerasikan tunas (Tabel 10).
Tabel 10. Persentase jumlah kalus membentuk tunas dan jumlah tunas per kalus
Kalus dari semua varietas yang diregenerasikan pada media NaCl memberikan hasil yang baik. Kemampuan regenerasi kalus semakin menurun seiring dengan mengkatnya kandungan NaCl. Persen kalus membentuk tunas (PKMT) dan jumlah tunas per kalus (JTPK) lebih tinggi pada Pokkali pada ketiga konsentrasi NaCl diikuti oleh Inpari 13, Inpara 3 Ciherang dan IR 29. Pada konsentrasi NaCl 50 mM pada kalus padi var Pokkali menghasilkan 85,71 PKMT dan 2,41 JTPK dan pada kalus padi var.IR 29 menunjukkan PKMT terendah yaitu 27 dan JTPK 1,39. Pada konsentrasi 100 mM NaCl kalus padi Pokkali menhasilkan PKMT 14 dan JTPK 19. Sedangkan pada padi varietas Ciherang, Inpari 13 dan Inpara 3 tidak menghasilkan tunas. Hal ini sejalan dengan
NaCl konsentrasi
(mM)
Persentase Kalus Membentuk Tunas (PKMT)
Jumlah Tunas Per Kalus (JTPK)
Ciherang Inpari 13 Inpara 3 Pokkali IR 29 Ciherang Inpari 13 Inpara 3 Pokkali IR 29
0 76.59 76.59 85.36 85.71 70,00 4,13 4,14 3,02 2,97 2,77
50 50,00 58,00 54 65.9 27,00 1,63 1,80 1,67 2,10 1,39
100 10,00 0,00 0,00 14,29 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00
150 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00
hasil penelitian Aditya & Backer (2006) yang melaporkan bahwa kemungkinan untuk beregenrasi pada kalus dari tanaman yang tidak toleran terhadap garam akan rendah karena NaCl yang diberikan menghambat regenerasi kalus membentuk tunas adventif.
Simpulan
Berdasarkan dari penelitian dapat disimpulkan bahwa nilai LC50 NaCl kalus padi varietas Ciherang untuk adalah 85,79 mM, Inpari 13 adalah 90,91 mM, Inpara 3 adalah 91,77 mM dan, IR29 adalah 70,67 mM. Peningkatan konsentrasi NaCl pada media kalus padi mengakibatkan peningkatan persentase kalus yang mencoklat, penurunan bobot basah kalus dan penurunan kemampuan kalus untuk beregenerasi membentuk tunas adventif.
6 PEMBENTUKAN GENOTIPE PADI TOLERAN SALINITAS PADI