HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul Keras
Lembaran simulasi cangkang kapsul keras dibuat dari standar gelatin sapi dan babi, sorbitol, aquadest, dan pewarna tartrazin. Penggunaan gelatin sebagai bahan utama didasarkan atas pemanfaatan sifatnya yang sebagai
gelling agent (GMIA, 2012).
a b
Gambar 4.1 a. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi b. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi
Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi yang dihasilkan berupa lembaran tipis, sedikit transparan, dapat digulung, berwarna kuning terang (asal gelatin babi) dan kuning cokelat (asal gelatin sapi). Perbedaan warna yang dihasilkan tersebut akibat dari warna asal serbuk gelatin (serbuk gelatin babi putih dan serbuk gelatin sapi kuning-cokelat). Hasil simulasi cangkang kapsul keras ditunjukkan pada gambar 4.1.
Kandungan air dari lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi yang dihasilkan berturut-turut adalah 10.6 % dan 10.15 %. Menurut Farmakope IV (1995) kandungan air dalam cangkang kapsul keras adalah 10 – 15% sehingga dapat disimpulkan bahwa kandungan air dalam lembaran simulasi cangkang kapsul keras yang dibuat memenuhi syarat.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.2. Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dari gelatin sapi, babi, dan simulasi sapi dan babi dengan cara mengekstraksinya. Metode ekstraksi yang digunakan ada dua cara, yaitu menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). Prinsip metode tersebut intinya sama yaitu penghancuran membran sel (cell lysis), pemurnian dari sel debris dan protein (purifikasi), dan presipitasi DNA (Muladno, 2010 dan Rochec, 2007).
4.2.1. Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)
Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) terdiri dari lima larutan yang terpisah dan memiliki spesifikasi masing-masing seperti yang terperinci dalam lampiran 4 Prinsip dari kit ini adalah DNA sampel diabsorpsi oleh Silikon Dioksida (SiO2) yang terdapat dalam filter tube dan selama pencucian dan pemusingan DNA tetap terikat dengan fiber glass sehingga ini dapat meminimalisir kehilangan DNA pada saat isolasi DNA (Izzah, 2014 dan Rochec, 2007).
Metode isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) mengikuti metode Izzah (2014) dengan mengalami modifikasi pada jumlah volume penggunaan Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, dan Proteinase K. Peningkatan jumlah volume penggunaan bahan tersebut berdasarkan arahan dari protokol Kit Roche® apabila dalam penggunaan prosedur isolasi tidak memberikan hasil yang memuaskan. Modifikasi pada penggunaan bahan tersebut didasarkan pada peran masing-masing, yaitu Tissue Lysis Buffer
sebagai penghancur membrane sel dikarenakan adanya EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) sehingga dengan penambahan jumlah penggunaannya maka semakin besar sel yang hancur akibatnya semakin banyak pula DNA yang keluar dari sel, Binding Buffer berperan dalam ikatan DNA dan Silikon Dioksida sehingga dengan menambahkan jumlah volume pemakaiannya maka semakin
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
banyak DNA yang terikat kuat, dan Proteinase K yang mempunyai peran untuk menghilangkan protein sehingga dengan begitu ketika jumlah Proteinase K ditingkatkan maka jumlah kontaminan protein dalam isolat DNA semakin kecil.
Keunggulan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) adalah sederhana dan ekonomis. Dikatakan sederhana karena dalam pengerjaannya tidak rumit (proses presipitasi dihilangkan) dan aman (risiko terpapar bahan toksik dapat dihindari seperti tidak adanya penggunaan kloroform dan deterjen). Metode ini juga relatif ekonomis karena tidak membutuhkan banyak pelarut namun kandungannya lengkap seperti diperlihatkan pada lampiran 4. Dalam penelitian yang menjadi kelemahan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) adalah relatif lama dalam pengerjaannya karena waktu proses lisis sel yang dilakukan overnight dan hanya dapat digunakan untuk beberapa reaksi saja.
4.2.2. Isolasi DNA dengan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)
Salah satu metode konvensional untuk isolasi DNA adalah dengan penggunaan deterjen dan agen pengkhelat dalam proses lisisnya (Muladno, 2010). Deterjen yang digunakan dalam penelitian adalah SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang merupakan deterjen kationik yang memiliki kemampuan dapat melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran sel sehingga struktur membran sel menjadi rusak (Kesmen,
et al., 2009; Maftuchah & Zainudin, 2006; dan Malisa et al., 2006).) Keberadaan agen pengkhelat seperti EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) dalam penelitian dapat memutuskan ikatan fosfodiester pada DNA dengan cara mengikat kation divalen yang merupakan aktivator bagi DNAse (Saili, 2006 dalam Rahmawati, 2012). Tahapan isolasi DNA mengikuti metode Utami, et al., (2012) dengan modifikasi pada jenis sampel yang diisolasi dan penambahan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
proteinase K. Sampel isolasi dalam penelitian ini adalah gelatin sapi dan babi dan simulasi sapi dan babi. Penambahan proteinase K bertujuan untuk menghilangkan kontaminan protein dalam isolat DNA dan memberikan aktivitas dari SDS 1% menjadi lebih optimal (Hilz, et al., 1975 dan Muladno, 2010).
Larutan yang digunakan dalam metode konvensional ini adalah kloroform, etanol absolut, dan etanol 70%. Fungsi dari kloroform adalah untuk presipitasi protein, sedangkan etanol absolut dan etanol 70% berturut-turut berperan sebagai presipitasi DNA dan purifikasi DNA (Utami, et al., 2012). Pada saat presipitasi DNA terbentuk 3 lapisan seperti yang diperlihatkan pada lampiran 5 yaitu lapisan atas adalah fase air, lapisan tengah adalah protein, dan lapisan bawah adalah fase organik (kloroform). Kejadian ini terjadi karena adanya perbedaan masa jenis. Masa jenis air lebih kecil (1 g/mL) dari masa jenis kloroform (1.4474 g/mL) shingga air berada di lapisan atas dan kloroform berada di lapisan bawah. Lapisan atas merupakan fase air yang mengandung DNA terlarut akibat dari sifat keduanya yang sama-sama polar. Sifat DNA yang polar dikarenakan adanya muatan negatif pada rantai fosfat sedangkan protein berada pada pelarut organik (kloroform) akibat sifatnya yang nonpolar (Rahmawati, 2002).
Proses presipitasi dilakukan dua kali yang bertujuan untuk memperkecil DNA dari kontaminan protein. Adanya DNA pada fase air maka lapisan ini diambil dan dipisahkan untuk proses presipitasi DNA. Presipitasi DNA menggunakan etanol absolut dengan cara membuat DNA menjadi kurang hidrofil sehingga DNA mengendap. Pemisahan endapan (pellet) dan supernatan perlu kehati-hatian karena akan menentukan pada kemurnian isolat yang dihasilkan.
Isolasi dengan metode SDS memiliki keuntungan, yaitu efisiensi waktu pengerjaan yang relatif cepat dan dapat digunakan beberapa kali reaksi. Pengerjaan yang relatif cepat dikarenakan proses lisis sel
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang hanya diperlukan 3 jam dalam penelitian sehingga total pengerjaan kurang lebih 5 jam (lihat tabel 4.1).
Tabel 4.1 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS
Nama Metode Waktu
Pengerjaan
Biaya (1xReaksi)
Tahapan Kit Roche®
± 23 jam ± Rp 30.800 Sederhana (tidak ada tahap presipitasi protein dan DNA)
SDS ± 5 jam ± Rp101.500 Rumit (ada pembuatan
larutan stok, ada tahap presipitasi protein dan DNA)
Namun, kekurangan metode ini adalah step-step pengerjaan yang cukup rumit, membutuhkan ketelitian yang ekstra terutama dalam hal pemisahan supernatan dan endapan (pellet) karena kemungkinan kehilangan isolat lebih tinggi akibat dari pengulangan tahapan tersebut dan tingkat keamanan yang harus diperhatikan karena kontak dengan bahan-bahan yang toksik (serbuk SDS, kloroform, etanol absolut) dalam jumlah yang cukup banyak serta membutuhkan biaya yang mahal.
4.2.3. Pengukuran Isolat DNA
Isolat DNA yang dihasilkan diukur menggunakan alat Spektrofotometer DNA (Biodrop®) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil analisis diinterpretasikan pada tabel 4.1.
Analisis isolat DNA didapatkan nilai konsentrasi (jumlah DNA) dan kemurnian. Pengukuran nilai konsentrasi didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam isolat. Secara maksimal penyerapan iradiasi oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan untuk protein pada panjang gelombang 280 nm (Muladno, 2010). Dari hasil yang
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan metode cell lysis buffer SDS 1% berkisar 16.73 – 20.83 ng/ µl, 4.55 – 11.97 ng/ µl, 13.30 – 15.39 ng/ µl, dan 20.53 – 36.99 ng/ µl. Hasil konsentrasi gelatin sapi dan babi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) yang didapatkan lebih besar dari penelitian sebelumnya yang hanya sekitar 19.38 ng/ µl untuk gelatin sapi dan 13.63 ng/ µl untuk gelatin babi (Izzah, 2014). Secara garis besar isolasi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) memperoleh konsentrasi DNA yang lebih tinggi dibandingkan metode isolasi dengan cell lysis buffer SDS 1% karena pada metode kit tidak terjadi proses presipitasi dan kandungan reagennya lebih banyak seperti adanya Urea dan Triton X namun pada simulasi babi sebaliknya metode SDS yang lebih tinggi.
Tabel 4.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®)
Nama Sampel
Nama Metode
Isolasi
Hasil
Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian (A260/A280) I II III Rata-rata a I II III Rata-rata a Gelatin Sapi Kit Roche® 27.84 31.63 48.77 36.08 ± 11.15 1.561 1.698 1.698 1.652 ± 0.079 SDS 16.73 20.83 19.26 18.94 ± 2.07 1.367 1.401 1.351 1.373 ± 0.026 Gelatin Babi Kit Roche® 3.71 11.70 16.90 10.77 ± 6.64 1.369 1.510 1.707 1.529 ± 0.170 SDS 4.55 9.09 11.97 8.536 ± 3.74 1.284 1.195 1.092 1.190 ± 0.096 Simulasi cangkang
kapsul dari gelatin sapi
Kit Roche® 8.70 13.82 19.01 13.84 ± 5.15 1.851 1.169 1.583 1.534 ± 0.343 SDS 13.57 15.39 13.30 14.09 ± 1.14 1.408 1.345 1.424 1.392 ± 0.041 Simulasi cangkang
kapsul dari gelatin babi
Kit Roche® 2.30 4.33 9.54 5.388 ± 3.73 1.772 1.310 2.013 1.698 ± 0.357 SDS 20.53 23.87 36.99 27.13 ± 8.70 1.283 1.299 1.276 1.286 ± 0.012
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Hasil pengukuran kemurnian yang didapatkan belum dikatakan murni. Menurut Muladno, (2010) bahwa DNA yang dikategorikan murni berkisar 1.8 – 2. Dalam penelitian, nilai kemurnian gelatin sapi, gelatin babi, simulasi sapi, dan simulasi babi pada metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) berturut-turut berkisar 1.561 – 1.698, 1.369 – 1.707, 1.169 – 1.851, dan 1.310
– 2.013 sedangkan metode cell lysis buffer SDS 1% berturut-turut 1.351 – 1.401, 1.092 – 1.284, 1.345 – 1.424, dan 1.276 – 1.299. Berdasarkan nilai-nilai tersebut dapat disimpulkan bahwa isolasi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation
(Roche®) memberikan hasil kemurnian yang lebih bagus dikarenakan adanya pengikatan DNA pada fiber glass (silikon dioksida) sehingga pencampuran dengan bahan lain dapat diminimalisir.
4.2.4. Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika
Analisis pengukuran isolat DNA dilakukan dengan bantuan program statistik, yaitu software IBM SPSS Statistics 20 bertujuan agar lebih mudah dan cepat. Adapun hasilnya disajikan dalam tabel 4.2.
Tabel 3. Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan simulasi menurut konsentrasi DNA
Metode Isolasi Mean SD c SE d P value N
Metode 1a Metode 2 b 16.520 17.174 13.500 7.881 6.750 3.941 0.936 4 4 Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)
b. Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)
c. Standar Deviasi d. Standar Error
Tujuan analisis dengan statistik adalah untuk mengetahui apakah ada perbedaan mean antara dua kelompok (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%). Uji yang dipakai adalah uji t tidak berpasangan karena terdiri dari 2 kelompok dan tidak saling ketergantungan (Hastomo, 2007). Syarat uji t adalah wajib berdistribusi normal dan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
data konsentrasi ini memenuhinya. Dari tabel 3. rata-rata konsentrasi DNA metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation
(Roche®) adalah 16.520 ng% dengan standar deviasi 13.500 ng%, sedangkan untuk metode cell lysis buffer SDS 1% rata-rata konsentrasi DNA-nya adalah 17.174 ng% dengan standar deviasi 7.881 ng%. Hasil uji statistik didapatkan nilai p=0.936, berarti pada alpha 5% terlihat tidak ada perbedaan yang signifikan rata-rata konsentrasi DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial
High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan metode isolasi DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%.
Tabel 4. Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan simulasi menurut kemurnian DNA
Metode Isolasi Mean SD c SE d P value N
Metode 1a Metode 2 b 1.60325 1.31025 0.084976 0.092500 0.042488 0.092500 0.003 4 4 Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)
b. Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)
c. Standar Deviasi d. Standar Error
Dari tabel 4.3 rata-rata kemurnian DNA metode kit komersial
High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) adalah 1.60325 dengan standar deviasi 0.084976 , sedangkan untuk metode cell lysis buffer SDS 1% rata-rata kemurnian DNA-nya adalah 1.31025 dengan standar deviasi 0.092500 . Hasil uji t didapatkan nilai p=0.003, berarti pada alpha 5% terlihat ada perbedaan yang signifikan rata-rata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan metode isolasi DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%.
4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul
