BAB III METODE PENELITIAN
3.8 Pembuatan Media
3.8.1 Pembuatan Media Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
Komposisi: DMEM sachet 10,4 gram
Hepes 2 gram
NaHCO3
HCl 1N secukupnya
2 gram
NaOH 1N secukupnya
Aquabidest steril ad 1 liter Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet DMEM, 2 gram Hepes dan 2 gram NaHCO3 dimasukkan
ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabidest steril, homogenkan dengan menggunakan Stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan asam klorida 1 N (bila larutan basa) atau natrium hidroksida 1 N (bila larutan asam) sehingga pH sesuai dengan kondisi yang diharapkan tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media (nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat) dan disimpan pada suhu 2 - 8o
3.8.2 Pembuatan Media Komplit DMEM (MK DMEM)
C (Sambrook, et al., 1989).
Komposisi: Fetal Bovine Serum (FBS) 10% Penisilin-Streptomisin 2% Fungizone (Amphotericin B) 0,5%
Cara Pembuatan:
Semua bahan di atas dicampur dan dilakukan di dalam LAF, tiap botol MK diberi identitas (nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat), disimpan pada suhu 2-8o
3.8.3 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
C (Sambrook, et al., 1989).
Komposisi: RPMI sachet 10,4 gram
Hepes 2 gram
NaHCO3
HCl 1N secukupnya
2 gram
NaOH 1N secukupnya
Aquabidest steril ad 1 liter Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes dan 2 gram NaHCO3 dimasukkan
ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabidest steril, homogenkan dengan menggunakan Stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan asam klorida 1 N (bila larutan basa) atau natrium hidroksida 1 N (bila larutan asam) sehingga pH sesuai dengan kondisi yang diharapkan tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media (nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat) dan disimpan pada suhu 2 - 8o
3.8.4 Pembuatan media kultur lengkap (MK-RPMI)
C (Sambrook, et al., 1989).
Komposisi: Fetal Bovine Serum (FBS) 10% Penisilin-Streptomisin 2% Fungizone (Amphotericin B) 0,5%
Cara Pembuatan:
Campur semua bahan di atas dan dilakukan di dalam LAF, beri identitas pada botol MK (nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat), simpan pada suhu 2-8o
3.8.5 Pembuatan Media M199
C (Sambrook, et al,.1989).
Komposisi: M199 sachet 9,5 gram Aquabidest 1 liter NaHCO3 Hepes 2 gram 2,2 gram HCl 1 N secukupnya NaOH 1 N secukupnya Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet M199, 2,2 gram NaHCO3, 2 gram Hepes dimasukkan ke
dalam tabung erlenmeyer. Ditambahkan 800 mL aquabidest steril dan dihomogenkan menggunakan Stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan asam klorida 1 N (bila larutan basa) atau natrium hidroksida 1 N (bila larutan asam) sehingga pH sesuai dengan kondisi yang diharapkan. Ditambahkan aquabidest hingga volume 1 L dan dilakukan sterilisasi dengan filter vacum di dalam LAF. Dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media (nama media, tanggal pembuatan, expire date, nama pembuat). Media disimpan pada suhu 2 - 8o
3.8.6 Pembuatan Media MK-M199
C (Handayani, dkk., 2001).
Komposisi: Fetal Bovine Serum(FBS) 10% Penisilin-streptomisin 3%
Fungison 1%.
Cara Pembuatan:
Campur semua bahan di atas dan dilakukan di dalam LAF, beri identitas pada botol MK (nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat), simpan pada suhu 2-8oC (Handayani, dkk., 2001).
3.9 Penumbuhan Sel MCF-7, Sel T47D dan Sel Vero 3.9.1 Penumbuhan sel
Dipersiapkan alat dan bahan dikondisikan pada suhu ruang. Pekerjaan dilakukan di LAF. Sebanyak 10 mL media penumbuh yang sesuai dengan masing- masing sel uji dimasukkan pada tabung konikel 15 mL. Diambil ampul dari
freezer -80°C atau tangki nitrogen cair, dicairkan pada suhu kamar. Suspensi sel
diambil dalam ampul, lalu dimasukkan tetes demi tetes ke dalam media penumbuh yang telah disiapkan. Disentrifus pada 600 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 4 mL MK-media penumbuh resuspensi hingga homogen. Ditransfer masing-masing 2 mL ke dalam flask baru. Sebanyak 5 mL MK–media penumbuh ditambahkan ke dalam masing-masing flask. Lalu dihomogenkan. Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted. Dipastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask (tidak menggerombol pada bagian tertentu). Diberi identitas pada flask, kemudian disimpan dalam inkubator CO2
3.9.2 Subkultur
(Doyle, et al., 2000).
Alat dipersiapkan dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, pengerjaan dilakukan pada LAF. Proses panen sel dilakukan dengan cara mengambil 500 µL panenan sel dan dimasukkan ke dalam flask kultur. Sebanyak 6 mL MK
ditambahkan dan dihomogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO2
3.9.3 Panen sel
dan diamati kondisi sel pada keesokan harinya (Doyle, et al., 2000).
Alat dipersiapkan dan bahan dikondisikan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80% konfluen, semua pekerjaan dilakukan pada LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, lalu dicuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS (Phosphate Buffer Salin), ditambahkan 400 µL Tripsin-EDTA 0,25% secara merata, kemudian dilakukan inkubasi di dalam inkubator CO2
3.9.4 Penghitungan sel
selama ± 5 menit dan ditambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol). Lalu diamati keadaan sel pada mikroskop
inverted. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Sel
ditransfer ke dalam tabung konikel (Doyle, et al., 2000).
Alat dipersiapkan dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 µL panenan sel dan dipipet ke dalam hemositometer. Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop dengan menggunakan counter.
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung (A, B, C dan D), setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Dihitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap (mati) dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas kanan dan bawah ikut dihitung. Dihitung jumlah sel per mL dengan rumus (Nugroho, et al., 2012):
∑sel/mL =∑sel A + ∑sel B + ∑sel C +∑sel D
4 x 10
4
Dihitung jumlah total sel yang diperlukan.
Misal: untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 1 x 104/sumuran x 100 sumuran (dibuat lebih) = 1 x 106.
Dihitung volume panenan sel yang diperlukan (dalam mL) dengan rumus: Volume panenan sel =Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung /ml
Diambil volume panenan sel, ditransfer ke tabung konikel baru dan ditambahkan MK sampai total volume yang diperlukan.