METODOLOGI PENELITIAN
I. Pembuatan Sari Buah Tomat untuk Menentukan konsentrasi sari buah jeruk nipissebagai pengawet
1. Tomat dikukus pada suhu 100o
2. Kulit ari tomat dikupas termasuk mata tomat warna coklat hitam tempat sepal atau tangkai buah dibuang.
C selama 15 menit sehingga kulit arinya mudah dilepas.
3. Buah tomat bersih sekitar 500 gram dipotong-potong, dimasukkan ke dalam blender skala laboratorium, diberi air sekitar 500 mL, diputar selama 3 menit, kemudia diberi tambahan air sekitar 500 mL, diputar selama 2 menit. Tahap ini diulang untuk buah tomat yang lainnya.
4. Buah tomat yang sudah dihaluskan dikumpulkan, difiltrasi, kemudian dihomogenkan dengan mendiamkan sari buah selama 30 menit.
5. Sari buah tomat dipasteurisasi pada suhu 60o 6. Sari buah tomat didinginkan
7. Analisis sari buah tomat untuk pH, total asam, kadar Vitamin C, kadar
Lycopene, Aktivitas antioksidan dengan DPPH.
8. Sari buah tomat dikelompokan menjadi 3 kelompok sesuai dengan kebutuhan pengujian.
9. Sari buah tomat diberi sari buah jeruk nipis sebagai pengawet alami masing-masing sebanyak 0% untuk Kelompok I, 0,5% untuk Kelompok II, dan 1% untuk Kelompok III.
10.Kelompok I, II, dan III dikemas menggunakan sealer cup plastik 240 mL masing-masing sebanyak 8 gelas cup untuk analisa.
11.Sari buah dalam kemasan direndam dengan air hangat masak pada suhu 60o
12.Sari buah dalam kemasan disimpan hingga 15 hari. C selama 15 menit. Kemudian diangkat dan ditiriskan.
13.Analisa sari buah tomat untuk pH, kadar Vitamin C, kadar antioksidan
Lycopene, TPC, aktivitas antioksidan metode DPPH, uji organoleptik yang akan dilakukan pada hari ke-0, minggu ke-5, minggu ke-10, dan minggu ke-15.
14.Diperoleh sari buah tomat dengan konsentrasi sari buah jeruk nipis dan waktu penyimpanan yang paling baik untuk diaplikasikan ke mencit untuk analisa SOD.
Penentuan pH
pH ditetapkan segera setelah ekstraksi jus dan setiap akan dilakukannya pengujian pada hari ke-0, ke-7, ke-14, dan ke-21. Pengukuran nilai pH merupakan salah satu parameter tingkat keasaman suatu produk (Winarno, 1974).
Penentuan total asam sari jeruk nipis dengan titrasi
Total keasaman jus ditentukan dengan metode titrasi terhadap natrium hidroksida menggunakan indikator phenolphthalein. Total keasaman ditentukan segera setelah ekstraksi jus dan hasilnya dinyatakan sebagai mg/mL jus. 10% sari buah disiapkan pada air distilasi. 10 mL dari sari buah 10% dititrasi dengan 0,1 N Natrium Hidroksida menggunakan fenolftalen sebagai indikator. Perubahan warna dari tidak berwarna menjadi merah muda pucat dicatat sebagai titik akhir. Total asam dihitung sebagai asam sitrat dengan menggunakan rumus (Kumari et al., 2013):
���������=�����������������������������
����������ℎ (��) � 1000 �������� �100%
Penentuan Kadar Vitamin C Menggunakan Metode Kolorimetri
Kadar Vitamin C ditentukan menggunakan instrument spektrofotometer pada panjang gelombang 518 nm merujuk pada Metode Anton Apriyantono, et. Al., 1989.
a. Pembuatan Larutan Dye
Larutan Dye dibuat dengan menimbang 100 mg 2,6-diklorofenol indofenol dan 84 mg Sodium bikarbonat. Kedua bahan tersebut dilarutkan ke dalam aquades hangat, kemudian disaring sampai 100 mL. larutan dipipet sebanyak 25 mL dan diencerkan menggunakan aquades hingga volume total 500 mL.
b. Pembuatan Kurva Standard Asam Askorbat
Asam askorbat ditimbang sebanyak 250 mg, dilarutkan hingga 100 mL dengan asam oksalat 2%. Larutan dipipet sebanyak 2 mL kemudian diencerkan sampai 100 mL dengan Asam oksalat 2%. Deret standar dibuat
sebanyak 5 titik yaitu dengan memipet larutan Asam askorbat sebanyak 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, dan 5 mL. Masing-masing asam askorbat tersebut dipaskan menjadi 5 mL dengan menambahkan pelarut asam oksalat. 10 mL larutan dye ditambahkan ke larutan standar kemudian dikocok lebih kurang 10 hingga 15 detik. Larutan diukur absorbansinya menggunakan spektroskopi pada panjang gelombang 518 nm. Data konsentrasi standar diinterpolasi dengan masing-masing data Absorbansi sehingga diperoleh persamaan kurva standar dengan nilai 0,9 ≤ R2
c. Penentuan Kadar Vitamin C Sari buah
≤ 1.
Sari jeruk nipis ditimbang sekitar 1 g ditambahkan asam oksalat 6%, disaring hingga volume 100 mL, kemudian 5 mL filtrate dimasukkan ke dalam tabung reaksi kering. Larutan dye sebanyak 10 mL ditambahkan,
kemudian diukur absorbansinya pada spektrofotometer dengan λ sebesar
518 nm. Nilai absorbansi dimasukkan ke dalam persamaan kurva standard Asam askorbat sehingga diperoleh konsentrasi Asam askorbat. Perhitungan kadar Vitamin C dihitung menggunakan persamaan berikut:
�������� � ��
100��=
���������������5������.������������
���������������� 100 ��� �100
BS = Berat sampel (g)
Penentuan kadar antioksidan Lycopene dengan metoda spektrofotometri Tomat segar dihaluskan dengan blender kemudian ditimbang 5 gram, masukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup yang dilapisi dengan kertas aluminium foil pada bagian luar & terlindungi dari cahaya tambahkan 50 ml larutan (heksana : aseton : etanol = 2 : 1 : 1) v/v, dikocok selama 30 menit dengan magnetik stirer,
pindahkan ke corong pisah kemudian tambahkan 10 ml air suling kemudian dikocok lagi selama 15 menit. Pisahkan lapisan polar dan lapisan non polar, ambil semua lapisan atas (non polar) masukkan dalam labu ukur 100 ml tambahkan pelarut organik sampai tanda batas. Kadar likopen total ditentukan dari lapisan non polar (bagian atas) dengan spektrofotometer UV – Vis pada panjang gelombang maksimum 471 nm. (Anonim, 2011)
Uji Aktivitas antioksidan dengan DPPH free radical scavenging assay
Kristal DPPH 50 mg dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, ditambahkan etanol sehingga konsentrasinya menjadi 0,05%. Kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh larutan DPPH 0,004%.
Pembuatan larutan DPPH
Sari buah tomat ditimbang sebanyak 0,25 g kemudian ditambahkan 1 mL DPPH. Etanol ditambahkan sedemikian hingga volume akhir tepat 5 mL. Campuran didiamkan selama 30 menit. Homogenisasi dilakukan selama 20 detik. Serapan dibaca pada spektrofotometer pada λ= 580 nm. Blanko larutan sari buah tomat dalam etanol. Larutan control yakni DPPH tanpa penambahan larutan uji.
Uji aktivitas antioksidan
Perhitungan aktivitas antioksidan
% �������������������=�������������� − �������������
Keterangan :
Serapan Kontrol : Serapan radikal DPPH pada panjang gelombang 580 nm.
Serapan Sampel: Serapan sampel dalam radikal DPPH pada panjang gelombang 580 nm
(Desmiaty et al., 2008)
Pengamatan mutu sari buah tomat secara mikrobiologi a. Persiapan sampel
1. Disiapkan alat pengujian yang sudah steril dan bahan, dipipet sampel sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan dalam botol pengencer yang berisi 9 ml aquadest steril (pengenceran 10-1
2. Dari pengenceran 10
)
-1
dipipet sebanyak 0,1 ml kemudian dimasukkan ke dalam botol pengencer yang berisi 9,9 ml aquadest steril (pengenceran 10
-3
b. Pengujian ALT (Angka Lempeng Total) Bakteri )
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Diambil 3 cawan petri yang steril dan diberi etiket.
3. Masing-masing cawan petri diisi 1 ml sampel berdasarkan
pengencerannya.
4. Ditambahkan 10 ml medium NA (nutrient agar) kedalam cawan petri kemudian dihomogenkan, dibiarkan memadat, diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37o
5. Diamati jumlah bakteri yang tumbuh dan dihitung nilai TPC nya. C.
Penentuan antioksidan Lycopene pada tikus secara in vivo
Pada penelitian ini akan dilakukan evaluasi aktivitas antioksidan Lycopene
dengan menetapkan kadar SOD ketika tikus-tikus percobaan diatur dengan perlakuan pemberian Acrylamide dan sari buah tomat. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental, dengan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL). Dua puluh lima ekor tikus Sprague Daweli Albino yang memiliki berat badan pada 160 – 200 gram, diadaptasikan di laboratorium selama 11 hari dan diberi pakan pellet dan minum secara ad libitum. Kemudian dibagi menjadi 5 (lima) kelompok masing-masing terdiri atas 5 (lima) ekor tikus dan diberi perlakuan sebagai berikut:
K0 : Kontrol Normal (tanpa pemberian Acrylamide, sari buah, hanya air) K- : Kontrol Negatif (tanpa pemberian Acrylamide, hanya sari buah tomat)
K+: Kontrol positif yang diberi perlakuan Acrylamide (tanpa pemberian sari buah tomat)
P1 : Kelompok yang diberi perlakuan Acrylamide dan sari buah tomat 2 ml per hari
P2 : Kelompok yang diberi perlakuan Acrylamide dan sari buah tomat 10 ml per hari
Dosis Acrylamide yang diberikan adalah 2,074 mg per ekor tikus yang diberikan setiap hari selama hari ke-12 hingga hari ke-22 (El Halim et al., 2008). Pengamatan visual kulit tikus dan pengukuran berat badan tikus dilakukan setiap 2 hari sekali. Makanan tikus dihitung sebagai gm/hari/tikus, dimana gm adalah perubahan berat badan tikus yaitu berat badan akhir – berat badan akhir tikus (Wongso et al., 2013).
Palpalasi nodul kanker
Palpalasi (perabaan) nodul kanker pada tikus yang telah diinkubasi
Acrylamide dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya perkembangan jaringan kanker pada tikus percobaan. Palpalasi dilakukan pada semua tikus yang telah selesai diinduksi setiap hari. Apabila ada nodul (organ kanker) dicatat diameter dan jumlah nodul sebagai hewan yang mengidap kanker (Wongso, 2013).
Prosedur pembuatan preparat histologi hati tikus
Sampel jaringan hati tikus diambil dan dicuci dengan NaCl fisiologis, kemudian difiksasi dengan larutan formalin buffer 10% (0,1 mol/L Phospat Buffer saline) PH 7, selama 6-48 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan alcohol 70%, 80%, 96%, dan alcohol absolut masing-masing 1 jam untuk pengeluaran air dari jaringan tersebut. Clearing atau penjernihan menggunakan xylol 1, 2 dan 3 selama 1 jam setelah itu dilakukan Impregnasi (penyusunan paraffin) dengan farafin cair 1 dan 2 suhu 60-70oC masing-masing selama 2 jam. Pada penelitian ini menggunakan mesin tissue processing otomatis dengan merk Leica TP 1020.
Embedding (parafinisasi) yaitu pembuatan blok paraffin dengan cara penanaman jaringan dalam kaset dan didinginkan, kemudian dilakukan proses sectioning (pemotongan), dengan menggunakan mikrotom setebal 5µm dan selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah penampung atau waterbath. Kemudian dilanjut dengan proses mounting dengan meletakkan sediaan di atas objek glas dan diolesi dengan glyserin. Proses terakhir adalah staining atau pewarnaan dengan hematoksilin eosin, tutup objek glas dengan menggunakan deck glass dan
entelan, kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan mulai dari 40x, 100x dan 400x. (Laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran USU, 2015)
Prosedur pewarnaan Hematoxylin Eosin
Blok sedian preparat yang telah diparafinisasi dicelupkan ke dalam cairan xylol yang ke 1, kemudian dicelupkan lagi ke dalam larutan xylol ke 2 dan terakhir kedalam larutan xylol yang ke 3 masing-masing selama 1 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alcohol absolut, alcohol 96%, alcohol 80%, dan alcohol 50% masing-masing 1 menit, kemudian dicuci di bawah air mengalir selama 1 menit dan dicelupkan ke dalam larutan Mayer’s Hematoxylin selama 5 menit, bilas dengan air mengalir selama 30 detik, kemudian dicelupkan ke dalam larutan asam alcohol 1% selama 15 – 30 detik, cuci kembali dengan air mengalir selama 2 menit kemudian blok sediaan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan agar tidak ada lagi sisa dari air, setelah itu dilakukan pewarnaan eosin selama 2-3 menit kembali dicuci di bawah air mengalir selama 30-60 detik. Kembali dicelupkan ke dalam alcohol 95% dan alcohol absolut lebih kurang sebanyak 10 kali celupan, kemudian dicelupkan lagi ke dalam xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit. Tetesi cairan prmount dan tutup dengan deck glass dan entelan, proses terakhir adalah blok sediaan diamati di bawah mikroskop cahaya merk Olympus CX21. (Laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran USU, 2015).
Prosedur pewarnaan Immunohistokimia
Dilakukan deparafinisasi slide memakai larutan Xylol 1,2, dan 3 masing-masing selama 5 menit, kemudian dilakukan proses rehidrasi untuk
menghilangkan sisa xylol dengan menggunakan larutan alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 80%, dan normal alkohol 70% masing-masing selama 4 menit, kemudian dicuci di bawah air mengalir selama 5 menit. Masukkan slide ke dalam mesin pengering merk PT. Link Dako Epitope Retrieval, kemudian diatur suhu
preheating 65oC, running time 98oC selama 15 menit, tunggu sampai ± 1 jam, setelah slide kering, dengan menggunakan spidol pap pen, preparat yang ada di slide dilingkari agar pada saat penetesan antibody atau cairan lainnya tidak keluar melewati batas lingkaran pap pen tadi. Segera masukkan slide ke dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit, kemudian dilakukan blocking dengan peroxidase, selama 5 – 10 menit, kemudian kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit , kemudian dilakukan blocking dengan Normal horse serum (NSH) 3%, selama 15 menit, cuci dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit. Setelah itu diinkubasi menggunakan SOD-1 polyclonal Antibody (3458-100, PT. Bio Vision, pengenceran 1:50) masing-masing selama 1 jam. Cuci kembali ke dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 atau Tween 20 selama 20 menit, kemudian tetesi dengan antibody sekunder merk Dako Real Envision Rabbit/Mouse selama 30 menit. Setelah itu slide kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 atau Tween 20 selama 5-10 menit. Kemudian slide ditetesi dengan DAB + Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20µL DAB : 1000 µL substrat (tahan 5 hari di suhu 2-8oC setelah dicampur) selama 5 menit, dicuci kembali dengan air mengalir dan dilakukan counterstain dengan Hematoxylin masing-masing selama 10 menit. Cuci dibawah air mengalir selama 5 menit, celupkan slide preparat ke dalam lithium carbonat (5% dalam aqua) selama 2
menit, cuci dengan air mengalir dan kembali dilakukan proses pengeringan cairan sebelumnya dengan proses dehidrasi menggunakan alkohol. (Laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran USU, 2015)
Uji Organoleptik
Uji organoleptik sari buah tomat meliputi uji rasa, aroma, warna, dan kekentalan. Sari buah tomat yang baik memiliki rasa juicy dan fresh, tekstur baik, warna merah seperti warna buah tomat segar dan masih memiliki aroma dari buah tomat.
Uji hedonik
Uji hedonik merupakan uji kesukaan. Panelis dimintakan tanggapan pribadinya tentang kesukaan atau sebaliknya (ketidaksukaan). Tingkat-tingkat kesukaan disebut skala hedonik, misalnya dalam hal “suka” dapat mempunyai skala hedonik seperti: amat sangat suka, sangat suka, suka, agak suka. Sebaliknya jika tanggapan itu “tidak suka“ dapat mempunyai skala hedonik seperti tidak suka dan sangat tidak suka, bisa juga netral, yaitu bukan suka tetapi juga bukan tidak suka ( neither like nor dislike ).
Analisis Data
Faktor A dan B masing-masing terdiri dari 3 faktor dan 4 faktor, sehingga analisis varians Faktorial dengan rancangan dasar RAL Pola Faktorial (3 x 4). Persamaan matematis sebagai berikut:
���� = µ+�� +��+ (��)�� +����
i = 1,2, dan 3 j = 1,2, dan 3 k = 1, 2, 3, ….5 Keterangan:
Yijk = Nilai fisikokimia dan TPC sari buah tomat ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan penambahan pengawet sari buah jeruk nipis ke-I dan waktu penyimpanan ke-j;
µ = Rata-rata nilai fisikokimia dan TPC sesungguhnya;
αi = Pengaruh perlakuan Level penambahan pengawet sari buah jeruk nipis ke-i;
βi = Pengaruh waktu penyimpanan ke-j
(αβ)ij = Pengaruh interaksi perlakuan ke-i dank e-j
Εijk = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j pada satuan percobaan ke-k
Apabila diperoleh hasil yang berbeda nyata dan sangat nyata maka akan dilakukan uji beda rata yaitu uji LSR (Least Significant Range)
Bagan penelitian 250 gr 500 gr Sortasi Air bersih Blancing (dikukus 100oC, 10 menit) Tomat plum 750 gr Peeling (tomat dikupas Pencucian
Analisis sebelum pengolahan 1. pH 4. Lycopene 2. total asam 3. Vitamin C Tomat dipotong-potong Milling I (diblender 3 menit) Air matang/ mineral 500 mL Milling II (diblender 2 menit) Air matang/ mineral 500 mL Filtrasi Penghomogenan
Gambar 14. Bagan Penelitian Pasteurisasi 60oC, 15 menit Analisis 1. pH 2. Total asam 3. Kadar Vitamin C 4. Kadar Lycopene 5. Aktivitas antioksidan DPPH
Sari buah tomat dingin
Sari buah tomat dengan pengawet sari
jeruk nipis Pengawet:
Sari buah jeruk nipis 1. 0% 2. 0,5% 3. 1% Pengemasan dengan gelas plastik 240 mL Pembilasan dengan air hangat
Sari buah tomat dalam gelas plastik 240 mL
Analisis (hari ke 0, ke 5, ke 10, dan ke 15) 1. pH
2. Total asam
3. Kadar Vitamin C 4. Kadar Lycopene 5. TPC
6. Aktivitas antioksidan metoda DPPH 7. Uji organoleptik
Kelompok tikus (K0, K-, K+, P1, P2)
Palpalasi (perabaan) nodul kanker hari ke dan hari ke-5 & ke-11
Dislokasi dan pembedahan tikus
Jaringan Hati tikus
Dicuci dengan NaCl fisiologi
Fiksasi dengan larutan formalin buffer 10% pH 7 (6 – 48 jam)
Didehidrasi dengan alcohol 70%, 80%, 96%, dan absolut @ 1 jam
Clearing/penjernihan dengan xylol 1,2 dan 3 selama 1 jam
Impregnasi (penyusunan paraffin) dengan farafin cair 60-70oC
Sectioning (pemotongan) dengan mikrotom berukuran 5µm
Mounting : meletakkan sediaan di atas objek gelas dan dioles dengan gliserin
Gambar 15. Bagan pengamatan hispatologi hati tikus Staining: pewarnaan dengan hematoksilin eosin
Gelas ditutup dengan deck glass dan entelan
Pengamatan dibawah mikroskop cahaya P.100x dan 400x
Jaringan Hati tikus
Defarafinisasi dengan larutan Xylol 1,2, dan 3 @ selama 5 menit
Rehidrasi menghilangkan xylol dengan alkohol absolut, 96%, 80%,70% @ 4 menit
Dicuci dibawah air mengalir selama 5 menit
Slide dimasukkan ke dalam mesin pengering merk PT. Link Dako Epitope Retrieval set up preheat 65oC, running time 98oC selama 15 menit, ditunggu sampai 1 jam
slide preparat dilingkari dengan spidol tempat penetasan antibody
Gambar 16. Bagan pewarnaan immunohistokimia
Blocking dengan normal horse serum (NSH) 3% selama 15 menit
Dicuci dibawah air mengalir selama 5 menit, dicuci dengan TBS pH 7,4 selama 5 menit
Diinkubasi dengan SOD-1 polyclonal antibody (PT. Bio Vision) @ 1 jam
Dicuci dalam larutan TBS pH 7,4 atau Tween 20 selama 20 menit
Ditetesi dengan antibody sekunder merk Dako Real Envision Rabbit/Mouse 30 menit
Slide ditetesi dengan DAB + Substrat Chromogen solution 5 menit
Dicuci kembali dengan air mengalir selama 5 menit
Counterstain dengan Hematoxylin @ 10 menit
Preparat dicelupkan ke dalam lithium carbonat (5%) selama 2 menit
Pengeringan cairan dengan proses dehidrasi menggunakan alkohol Dicuci dibawah air mengalir selama 5 menit