BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan
3.3.3 Pembuatan simplisia
Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun segar. Daun dipisahkan dari pengotor lain lalu dicuci hingga bersih kemudian ditiriskan dan ditimbang (diperoleh berat basah sebesar 4.284 g). Selanjutnya dikeringkan dalam lemari pengering sampai daun kering (ditandai bila diremas rapuh). Simplisia yang telah kering diblender menjadi serbuk, lalu ditimbang sebagai berat serbuk simplisia (875 g), dimasukkan ke dalam wadah plastik bertutup, dan di simpan pada suhu kamar.
3.3.4 Pemeriksaan karakteristik simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia yaitu pemeriksaan makroskopik, dilakukan pada daun segar dan simplisia terdiri dari pemeriksaan warna, rasa, ukuran, dan bentuk daun Afrika.
3.4 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Afrika
Serbuk simplisia diekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Menurut Farmakope Indonesia Edisi III, (1979) caranya adalah sebagai berikut:
Sebanyak 400 g (10 bagian) serbuk simplisia dimasukkan ke dalam sebuah bejana, dituangi dengan 3 L (75 bagian) etanol, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, diserkai, diperas. Ampas diremaserasi dengan etanol secukupnya hingga diperoleh 4 L (100 bagian). Pindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat terlindung dari cahaya selama 2 hari. Enap tuangkan atau saring. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary evaporator pada suhu 40°C, selanjutnya diuapkan di waterbath pada suhu 40°C sampai diperoleh ekstrak kental.
21
Pembuatan nanopartikel daun Afrika di lakukan di Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Prosedur pembuatan sebagai berikut:
a. Masukkan bola‐bola yang akan digunakan sebagai media penghancur ke dalam jar/vial HEM.
b. Bola‐bola dengan ukuran diameter lebih besar dimasukkan terlebih dahulu, kemudian bola‐bola dengan ukuran diameter lebih kecil, dan terakhir sampel dimasukkan.
c. Volume total dari Bola‐bola dan Sampel yang bisa dimasukkan dalam jar/vial tidak boleh melebihi 2/3 volume jar/vial.
d. Sampel yang bisa dimilling adalah material logam, keramik dan mineral alam, dan ukuran pada hasil milling tergantung pada material yang dimilling. e. BPR (Ball to Powder Ratio) yang biasa digunakan adalah 20:1, 10:1, dan 8:1,contoh BPR 20:1 dimana setiap 20 gr berat bola yang digunakan maka 1 gr sampel dapat dimilling.
f. Tutup jar/vial yang telah berisi bola dan sampel dengan rapat.
g. Pasangkan jar/vial pada dudukan jar/vial yang terdapat dalam HEM. Nyalakan HEM dengan mengoperasikan tombol‐tombol elektronik.
3.6 Pemeriksaan Karakteristik Nanopartikel Daun Afrika (NDA)
Pemeriksaan karakteristik nanopartikel daun Afrika menggunakan mikroskop elektron payaran dan pengukur ukuran partikel.
3.6.1 Mikroskop elektron payaran
Mikroskop elektron payaran atau scanning electron microscope (SEM) terdiri dari sebuah senapan elektron yang memproduksi berkas elektron pada
22
tegangan dipercepat sebesar 2 – 30 kV. Berkas elektron tersebut dilewatkan pada beberapa lensa elektromagnetik untuk menghasilkan gambar berukuran kecil dari 10 nm pada sampel yang ditampilkan dalam bentuk film fotografi atau ke dalam tabung layar (Anggraeni, 2008).
Pemeriksaan karakteristik nanopartikel daun Afrika dengan alat SEM dilakukan di Universitas Negeri Padang Jl. Prof. Dr. Hamka Air Tawar Padang.
3.6.2 Pengukur ukuran partikel
Pengukur ukuran partikel atau particles size analyzer (PSA) merupakan pengujian ukuran partikel dengan range 2-7000 nm menggunakan prinsip dynamic ligh scattering dan gerak brown. Ukuran partikel dihitung berdasarkan fungsi korelasi Stokes-Einstein dan gerak Brown ditetapkan sebagai koefisien difusi translasi. Kecepatan gerak Brown dipengaruhi oleh size, viscosity dan
temperature. Keluaran yang dihasilkan merupakan sistem dari statistical, commulant dan laplace methods, dimana masing-masing sistem menghasilkan size distribution dalam intensity, number dan volume (Anonim, 2013).
Pemeriksaan karakteristik nanopartikel daun Afrika dengan alat PSA dilakukan di Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor.
3.7 Pembuatan Pereaksi
Pembuatan pereaksi mencakup larutan Aloksan, suspensi Na-CMC 0,5%, suspensi Glibenklamid dosis 0,65 mg/kg bb, suspensi Metformin dosis 65 mg/kg bb, suspensi NDA dosis 50, 100, 150, dan 200 mg/kg bb, suspensi EEDA dosis 100, 150, dan 200 mg/kg bb.
23
Sebanyak 150 mg aloksan dilarutkan dalam larutan NaCl 0,9% (Vogel, 2008) dibuat sebanyak 10 mL.
3.7.2 Pembuatan suspensi Na-CMC 0,5%
Sebanyak 0,5 g Na-CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi ±10 mL air suling panas. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh massa yang transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling, dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 100 mL, dicukupkan volumenya dengan air suling hingga garis tanda.
3.7.3 Pembuatan suspensi Glibenklamid dosis 0,65 mg/kg BB
Sebanyak 1 tablet glibenklamid dosis 5 mg/kg bb, diambil dan dimasukkan ke dalam lumpang lalu ditambahkan suspensi Na-CMC 0,5% b/v sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen, volume dicukupkan hingga 10 mL. 3.7.4 Pembuatan suspensi Metformin dosis 65 mg/kg BB
Sebanyak 1 tablet metformin dosis 500 mg, diambil dan dimasukkan ke dalam lumpang dan ditambahkan suspensi Na-CMC 0,5% b/v sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen, volume dicukupkan hingga 10 mL.
3.7.5 Pembuatan suspensi nanopartikel daun Afrika (NDA)
Dalam pengujian digunakan 4 variasi dosis yakni dosis 50, 100, 150, dan 200 mg/kg bb. Sejumlah 50, 100, 150, dan 200 mg NDA dimasukkan ke dalam lumpang dan ditambahkan suspensi Na-CMC 0,5% b/v sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen hingga 10 mL.
24
3.7.6 Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun Afrika (EEDA)
Dalam pengujian digunakan 3 variasi dosis yakni dosis 100, 150, dan 200 mg/kg bb. Sejumlah 100, 150, dan 200 mg EEDA dimasukkan ke dalam lumpang dan ditambahkan suspensi Na-CMC 0,5% b/v sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen hingga 10 mL.
3.8 Pengujian Efek Antidiabetes Nanopartikel Daun Afrika dan Ekstrak Etanol Daun Afrika
Pengujian efek antidiabetes nanopartikel dan ekstrak etanol daun Afrika terdiri dari penggunaan alat glucose test meter Nesco®GCU, pengukuran kadar glukosa darah, pengujian efek antidiabetes nanopartikel daun Afrika (NDA) dan ekstrak etanol daun Afrika (EEDA) dengan metode toleransi glukosa dan induksi aloksan.
3.8.1 Penggunaan blood glucose test meter “Nesco®GCU”
Kadar glukosa darah diukur dengan alat glukometer menggunakan strip tes yang bekerja secara enzimatis.
Alat yang digunakan untuk mengukur kadar glukosa darah adalah gluko meter Nesco®GCU. Glukometer ini secara otomatis akan hidup ketika strip tes dimasukkan dan akan mati setelah beberapa menit strip tes dicabut. Strip tes
Nesco®GCU dimasukkan ke alat Nesco®GCU sehingga glukometer ini akan hidup secara otomatis, kemudian dicocokkan kode nomor yang muncul pada layar dengan yang ada pada vial strip tes Nesco®GCU. Tes strip yang dimasukkan pada glukometer pada bagian layar akan tertera angka yang harus sesuai dengan kode vial strip tes Nesco®GCU, kemudian pada layar monitor glukometer muncul tanda siap untuk diteteskan darah. Caranya dengan menyentuh 1 tetes darah yang
25
penuh oleh darah, alat mulai mengukur kadar glukosa darah. 3.8.2 Pengukuran kadar glukosa darah (KGD)
Kadar glukosa darah mencit yang dipuasakan (tidak diberi makan tetapi tetap diberi minum) selama 18 jam sebelum percobaan diukur menggunakan gluko meter Nesco®GCU. Masing-masing mencit diukur dengan diambil darah mencit melalui pembuluh darah vena, setelah ekor mencit didesinfektan dengan etanol 70%, ujung ekor digunting secara aseptik (Thomson, 1985) tetesan darah pertama dibuang, tetesan berikutnya diserapkan pada test strip yang terselip pada alat. Sejumlah darah tertentu akan terserap sesuai dengan kapasitas serap test strip, setelah itu perdarahan ekor mencit dihentikan, dalam waktu 15 detik pada layar tertera kadar glukosa darah dalam satuan mg/dL.
3.8.3 Pengujian efek antidiabetes nanopartikel daun Afrika (NDA) dan ekstrak etanol daun Afrika (EEDA) dengan metode toleransi glukosa Mencit jantan sebanyak 45 ekor dengan berat badan 2 5– 35 g yang telah dipuasakan ditimbang berat badannya, diukur kadar glukosa darah (KGD) puasa, dikelompokkan secara acak menjadi 9 kelompok, yang masing – masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit dan diberi perlakuan secara oral, yakni:
Kelompok I : suspensi Na-CMC 0,5 % b/v Kelompok II : suspensi NDA dosis 50 mg/kg bb Kelompok III : suspensi NDA dosis 100 mg/kg bb Kelompok IV : suspensi NDA dosis 150 mg/kg bb Kelompok V : suspensi NDA dosis 200 mg/kg bb Kelompok VI : suspensi EEDA dosis 100 mg/kg bb
Kelompok VII : suspensi EEDA dosis 150 mg/kg bb Kelompok VIII : suspensi EEDA dosis 200 mg/kg bb Kelompok IX : suspensi Glibenklamid 0,65 mg/kg bb
26
Setiap kelompok yang telah diberikan sediaan uji, 30 menit kemudian diberikan larutan glukosa 50% dengan dosis 3 g/kg bb, kemudian dilakukan pengukuran KGD pada menit ke-30, 60, 90 dan 120 (Adnyana, dkk., 2004) dengan menggunakan alat ukur glukometer Nesco®GCU.
3.8.4 Pengujian efek antidiabetes nanopartikel daun Afrika (NDA) dan ekstrak etanol daun Afrika (EEDA) metode induksi aloksan
Mencit jantan sebanyak 30 ekor dengan berat badan 25 – 35 g yang telah dipuasakan ditimbang berat badannya, ditentukan kadar glukosa darah puasa, kemudian masing-masing mencit diinduksi dengan aloksan dosis 150 mg/kg bb secara intraperitoneal (Oguwike, et al., 2013). Mencit diberi makan dan minum seperti biasa, diamati tingkah laku dan bobot badan, mencit dianggap diabetes apabila kadar glukosa darah puasa ≥ 200 mg/dL (Tanquilut, et al., 2009) dan telah dapat digunakan untuk pengujian.
Mencit diabetes dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok, masing- masing kelompok terdiri dari 5 ekor dan diberi perlakuan secara oral, yakni:
Kelompok I : suspensi Na-CMC 0,5 % b/v Kelompok II : suspensi NDA dosis 100 mg/kg bb Kelompok III : suspensi NDA dosis 150 mg/kg bb Kelompok IV : suspensi NDA dosis 200 mg/kg bb Kelompok V : suspensi EEDA dosis 150 mg/kg bb Kelompok VI : suspensi Metformin dosis 65 mg/kg bb
Keenam kelompok diberi sediaan uji selama 3 minggu berturut-turut, pengukuran kadar glukosa darah diukur pada hari ke-3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 dan ke-21 menggunakan alat ukur glukometer Nesco®GCU.
27
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program Statistic Product and Service Solutions (SPSS) versi 19. Pertama data dianalisis menggunakan metode Kolmogorov Smirnov untuk menentukan homogenitas dan normalitasnya. Kemudian dilanjutkan dianalisis menggunakan metode one-way analysis of variance (ANOVA) untuk menentukan perbedaan rata-rata diantara kelompok. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji Post Hoc Tukey HSD untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan.
28