4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik dan Identitas Isolat
4.3.2 Pemilihan Media Starter
Media starter dipilih dengan melihat pertumbuhan selama proses kultivasi dapat melalui pengamatan perubahan pH cairan kultivasi, pengukuran jumlah sel, dan pengukuran pembentukan spora serta konsumsi substrat dengan melihat total gula sisa pada cairan kultivasi. Bahan yang digunakan sebagai media starter limbah cair tahu (LCT), air kelapa (AK) dan limbah cair tahu tambah urea (LCTU), penambahan urea disesuaikan dengan C/N rasio pada nutrient broth.
Nutrient broth (NB) digunakan sebagai pembanding yang merupakan media kaya nutrisi, dimana NB dibuat dari ekstrak daging sapi yang mengandung basa organic dan pepton yaitu produk hidrolisat protein hewani atau nabati seperti otot, hati, darah, susu, casein, gelatin dan kedelai, disamping itu juga mengandung yeast extract yang kaya akan vitamin, mineral dan asam nukleat. Komponen penyusun NB (HiMedia Laboratories) adalah pepton 15 g/L, yeast extract 3 g/L dan natrium klorida 6 g/L, dan dextrose 1 g/L, bahan tersebut merupakan komponen yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel vegetatif B. thuringiensis sangat mencukupi dalam NB.
Perubahan pH selama kultivasi dijelaskan pada Gambar 21, pada media LCTU pada jam ke-4 menunjukan kenaikan pH yang mencolok yang disebabkan karena B. thuringiensis menghasilkan urease, dimana urease berperan dalam ketersediaan energi internal dan eksternal untuk penggunaan urea sebagai sumber nitrogen. Urease akan menguraikan urea menjadi amoniak dan karbondioksida (Martin et al. 2010) sehingga pH naik menjadi 9.3. Ini mengakibatkan kondisi medium menjadi tidak optimum untuk pertumbuhan B. thuringiensis. Kondisi pH
Tabel 6 Komposisi mineral media starter Komponen Nutrient Broth (8g/L)
(ppm)
Limbah Cair Tahu (ppm) Air Kelapa (ppm) Kalsium 17.12 249.25 325.96 Besi 0.48 5.32 5.89 Mangan 0.24 0.02 0.42 Magnesium 0.72 31.51 13.58 Seng 5.12 2.42 18.64
35 optimum untuk pertumbuhun B. thuringiensis. menurut Benhard dan Utz (1993) adalah 5.5-8.5, ini mengakibatkan pertumbuhan sel lebih lambat diawal kultivasi dibandingkan media NB dan LCT (Gambar 23). Setelah nitrogen sebagian dikonsumsi dan karbon dioksida pH mengalami sedikit penurunan, tetapi tidak turun terus, setelah jam ke-12 mengalami sedikit peningkatan. Hal ini disebabkan
B. thuringiensis menghasilkan protease (Martin et al. 2010). Protease akan mengkatalisis reaksi hidrolisis protein menjadi oligopeptida atau asam-asam amino.
Pada masa eksponensial sel Bt. media NB dan LCT mengkonsumsi karbohidrat dan mengurainya sehingga menghasilkan asam organik seperti asam laktat, asam piruvat dan asam asetat, menyebabkan pH turun (Norris, 1977). Selanjutnya terjadi peningkan pH karena pemanfaatan karbohidrat sebelum masa sporulasi. Selain itu peningkatan pH bisa disebabkan oleh pemanfaatan kembali asam asetat yang terakumulasi dalam medium untuk memproduksi poli-- hidroksibutirat (PHB) (Tirado-Montiel et al. 2001). Hal ini dimungkinkan bila melihat kekerabatan isolat A dekat dengan B. thuringiensis strain IAM 12077 (Gambar17). Menurut Adwitiya et al. (2009) B. thuringiensis strain IAM 12077 dapat dimanfaatkan untuk produksi PHB yang dapat dimanfaatkan sebagai bioplastik.. Disamping itu juga karna B. thuringiensis menghasilkan protease yang akan mengkatalisis reaksi hidrolisis protein. NB mengandung protein yang lebih tinggi, sehingga mengalami peningkatan pH lebih cepat dan lebih tinggi dibanding LCT. Sebaliknya media air kelapa mengalami penurunan sampai jam ke-24, walaupun penurunannya tidak terlalu tajam, masih berada pada kondisi optimum untuk pertumbuhan B. thuringiensis. Air kelapa memiliki kadar gula yang tinggi. Menurut Martin et al. (2010) 34 % dari isolat yang diteliti dapat memproduksi asam dari sukrosa, hal ini yang menyebabkan pH turun.
Perubahan gula yang dikonsumsi selama proses kultivasi diperlihatkan pada Gambar 22. Selama kultivasi terlihat penurunan karbohidrat yang terjadi pada media NB dan air kelapa lebih banyak dibandingkan media LCT dan LCTU.
Jenis karbohidrat yang terkandung pada NB dan AK adalah gula sederhana yang dapat dengan mudah dikonsumsi oleh mikroorganisme, sedangkan pada
Gambar 21 Perubahan pH selama kultivasi pada media NB, LCT, LCTU dan AK 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 4 8 12 16 20 24 pH
Lama kultivasi (jam)
NB LCT LCTU AK
36
LCT dan LCTU sebagian karbohidratdalam bentuk oligosakarida sehingga diperlukan kerja enzim amylase untuk menguraikan dulu menjadi monosakarida baru bisa dikonsumsi oleh B. thuringiensis.
Secara umum pertumbuhan B. thuringiensis pada keempat media dapat berkembang dengan baik, terlihat bahwa pertumbuhan B. thuringiensis dan lama waktu kultivasi menunjukkan korelasi yang positif dimana semakin lama waktu kultivasi semakin meningkat jumlah sel maupun jumlah sporanya, tetapi berbeda secara kuantitatif.
Jumlah sel tertinggi berturut-turut pada media nutrient broth (NB), limbah cair tahu (LCT), limbah cair tahu dengan urea (LCTU) dan air kelapa yaitu 10.25
Gambar 23 Pertumbuhan sel selama kultivasi pada media nutrient broth, limbah cair tahu, limbah cair tahu dengan urea dan air kelapa
Gambar 22 Perubahan Total gula selama kultivasi pada media nutrient broth, limbah cair tahu dan limbah cair tahu dengan urea.
0 2 4 6 8 10 12 0 4 8 12 16 20 24 Ju m lah s el (L o g C FU/m L )
Lama kultivasi (jam)
NB LCT LCTU AK 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 4 8 12 16 20 24 T o tal g u la (%)
Lama kultivasi (jam)
NB LCT LCTU AK
37 LogCFU/mL, 10.51 LogCFU/mL, 10.86 LogCFU/mL dan 7.03 LogCFU/mL. Dari data tersebut menunjukan pertumbuhan sel tertinggi pada media yang menggunakan LCTU dan yang terendah menggunakan media AK, walaupun nilainya tidak berbeda jauh dengan yang dihasilkan LCT dan NB ini menunjukan sel dapat tumbuh baik dalam media LCTU, karena LCTU mengandung karbon dan nitrogen dengan rasio yang sama dengan NB tetapi memiliki kandungan mineral yang lebih tinggi dibandingkan dengan NB. Sedangkan untuk pembentukan spora yang tinggi pada media LCT dan LCTU karna media tersebut memiliki kandungan mineral yang mendukung untuk terbentuknya spora terutama adanya ion Ca yang tinggi dibandingkan dengan yang ada pada NB.
Fase adaptasi keempat media terjadi pada waktu kultivasi jam ke-0 hingga ke-4. Lamanya waktu adaptasi sangat ditentukan oleh jumlah sel yang diinokulasikan, kondisi fisiologis dan morfologis yang sesuai serta media kultivasi (Scragg 1991). Kurva pertumbuhan sel (Gambar 23) fase logaritmik sudah tercapai pada jam ke-12 pada media NB dan LCT, jam ke-20 untuk media LCTU dan jam ke-16 untuk media AK. Berdasarkan pola pertumbuhan logaritmiknya laju pertumbuhan spesifik () maksimun tertinggi pada media LCT sebesar 0.052 jam-1. Selanjutnya hingga akhir waktu pertumbuhan jam ke-24, sel mengalami fase pertumbuhan yang relatif retap atau memasuki fase stasioner. Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati.
Pembentukan spora mulai terjadi pada jam ke-4. Media yang mengalami pembentukan spora paling cepat dan tertinggi adalah yang menggunakan media LCT. Jumlah spora tertinggi pada berturut-turut pada media NB, LCT, LCTU dan AK adalah 6.36 LogCFU/mL, 8.67 LogCFU/mL, 8.14 LogCFU/mL dan 6.80 LogCFU/mL. Hal ini menunjukan spora terbentuk lebih baik pada media LCT selain terbentuk spora lebih tinggi dibanding menggunakan media yang lain, laju pertumbuhanan spora maks pada jam ke-16, lebih cepat dibanding media NB dan LCTU (Gambar 24).
Kemampuan mikroorganisme melakukan biokonversi yang merubah nutrisi menjadi sejumlah sel dan metabolit dapat dihitung melalui koifisien yield, sebagai
Gambar 24 Produksi spora selama kultivasi pada media nutrient broth, limbah cair tahu dan limbah cair tahu dengan urea
0 2 4 6 8 10 0 4 8 12 16 20 24 Ju m lah sp o ra (L o g CF U/m L )
Lama kultivasi (jam)
NB LCT LCTU AK
38
jumlah sel (YN/S) dan produk (YP/S) yang dibentuk dibentuk per unit masa nutrient yang dikonsumsi, sehingga koefisien yield menunjukan efisiensi biokonversi (Wang et al. 1979). Hasil perhitungan kinetika kultivasi terlampir pada Tabel 6. Pada media nutrient broth kinetika kultivasi pertumbuhan sel terhadap konsumsi gula (YN/S) sebesar 14.37 Log CFU/mg karbohidrat dan pertumbuan spora terhadap konsumsi karbohidrat (YP/S) 13.84 Log CFU/mg karbohidrat. Hasil tersebut menjelaskan bahwa gula lebih banyak dikonversi menjadi sel dibandingkan menjadi spora. Nilai efisiensi pemanfaatan substrat (S/S0) 52.55 % menunjukan banyaknya karbohidrat yang dimanfaatkan menjadi biomassa dan produk. Pada media Limbah cair tahu (YN/S) sebesar 25.34 Log CFU/mg karbohidrat dan (YP/S) 39.08 Log CFU/mg gula. Hasil tersebut menjelaskan bahwa gula lebih banyak dikonversi menjadi spora dibandingkan menjadi sel. Nilai efisiensi pemanfaatan substrat (S/S0) 27.57%. Dan pada media limbah cair tahu ditambah urea (YN/S) sebesar 21.14 Log CFU/mg gula dan (YP/S) 36.90 Log CFU/mg gula. Hasil tersebut menjelaskan bahwa gula lebih banyak dikonversi menjadi spora dibandingkan menjadi sel. Nilai efisiensi pemanfaatan substrat (S/S0) 25.14%. Nilai efisiensi penggunaan substrat untuk pertumbuhan sel masih belum optimal. Untuk meningkatkan efisiensi penggunaan substrat, proses pengadukan yang tepat perlu diperhatikan karena akan mempengaruhi transfer substrat secara merata sehingga menghasilkan metabolisme yang lebih baik.
Parameter kinetika pertumbuhan media limbah, sebagai pembanding digunakan nutrient broth (NB) (Tabel 7) terlihat bahwa media NB menghasilkan spora yang rendah dibandingkan media LCT dan LCTU. Menurut Pearson dan Ward (1988) media yang mengandung protein tinggi seperti NB dapat menghambat sporulasi karena terjadinya pengaruh respirasi katabolit nitrogen. Pada media AK juga rendah kemungkinan karena komposisi C/N rasionya terlalu besar, seharusnya diberi tambahan lagi sumber N.
Tabel 7 Parameter kinetika kultivasi B. thuringiensis padaberbagai media limbah
Parameter NB Media limbah
LCT LCTU AK
N-max (Log CFU/mL) 10.2+0.3 10.5+0.1 10.8+0.7 7.0+0.3 P-max (Log CFU/mL) 6.3+0.3 8.7+0.7 8.1+0.4 6.8+0.3 µN-max (Jam-1) 0.045+0.004 0.052+0.005 0.025+0.002 0.019+0.002
YN/S (Log CFU/mg gula) 14.3+0.1 25.3+0.3 21.1+0.4 4.2+0.2
YP/S (Log CFU/mg gula) 13.8+0.1 39.1+0.4 36.9+0.4 12.8+0.7
(S0-St)/S0 (%) 52.5+0.5 27.5+0.7 25.1+0.3 44.0+0.4
Dengan melihat Laju pertumbuhan sel maksimum (µN-max) tertinggi dan jumlah spora maksimum yang tertinggi media terpilih adalah LCT, oleh sebab itu media LCT dapat digunakan sebagai media starter.
39
4.4 Produksi Bioinsektisida Menggunakan Ampas Sagu dan Ampas Iles-iles