SIMPULAN DAN SARAN - Proses Produksi Bioinsektisida Bacillus thuringiensis Isolat Lokal Menggun

Simpulan

Isolat hasil isolasi dari bangkai ulat A. atlas dan Bombyx mori memiliki kemiripan morfologi dengan B., dan dari rekonstruksi pohon philogenetik menunjukan satu cluster dengan B. thuringiensis. Isolat terpilih untuk kultivasi media padat adalah isolat yang berasal dari bangkai ulat A. atlas karena memiliki motilitas, jumlah spora dan toksisitas yang lebih tinggi dibandingkan isolat dari B. mori.

Limbah cair tahu dapat digunakan sebagai media starter, karena memiliki komposisi kimia yang dibutuhkan untuk pertumbuhan B. thuringiensis, sehingga menghasilkan jumlah sel maksimum, pembentukan spora maksimum dan laju pertumbuhan maksimum yang lebih baik dibandingkan limbah air kelapa, bahkan dengan nutrient broth yang merupakan media komersial yang kaya nutrisi.

Produksi bioinsektisida menggunakan campuran ampas sagu dan ampas iles-iles sebagai media tumbuhnya, dengan cara kultivasi media padat. Kondisi proses yang terbaik dengan melihat pertumbuhan sel, spora yang dihasilkan, jumlah asam amino dan efikasi adalah pada ketebalan media 3 cm dan menggunakan aerasi. Pemberian aerasi memberi pengaruh yang lebih baik karena dapat meningkatkan jumlah sel, jumlah spora dan asam amino yang terbentuk.

Toksisitas terhadap larva nyamuk A. aegepty. maupun larva C. pavonana

tidak dipengaruhi oleh jumlah sel, sedangkan jumlah spora memperlihatkan semakin tinggi spora semakin tinggi nilai toksisitasnya. Berarti pembentukan spora sejalan dengan pembentukan protein kristal. Bioinsektisida yang dihasilkan memiliki daya toksisitas terhadap larva C. pavonana dan larva A. aegepty tetapi lebih efektif terhadap larva A. aegepty.

Penggunaan limbah cair tahu, ampas sagu pada produksi bioinsektisida dapat memberikan nilai tambah yang cukup besar, sedangkan nilai tambah pada ampas iles-iles tidak terlalu besar.

Saran

Perlu dilakukan penelitian berikutnya untuk melihat pengaruh besarnya laju aerasi dengan ketebalan substrat yang berbeda. Selain itu perlu dikaji downstream processing yang lebih tepat, agar diperoleh potensi produk yang lebih tinggi dan bisa dipasarkan secara komersial.

DAFTAR PUSTAKA

Aditiya P, Ashwini P, Avinash AK, Badri R, Kajal D. 2009. Mutagenesis of

Bacillus thuringiensis IAM 12077 for increasing poly (-β-)hydroxybutyrate (PHB) production. Turk J Biol. 33:225-230.

Altschul SF, Madden TL, Scaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs. Nucleic Acid Res 25(17): 3389-3402.

[AOAC]. 2005. Official Methods of Analysis of The Association of Official Agricultural Chemist. Washington DC.

Apaydin. 2004. Isolation and Characterization of Bacillus thuringiensis Strains from Different Grain Habitats [disertasi]. Izmir, Turkey: Izmir Institute of Technology.

[APHA]. 2012. American Public Health Association. Standard Method for The Examination of Water and Wastewater. Washington DC.

Asben A, Irawadi TT, Syamsu K, Haska N. 2012. Kajian Potensi dan Pemanfaatan Limbah Ampas Sagu setelah Pretreatment. J Lumbung. Politani Payakambuh. 11(1): 1-11.

Awg-Adeni DS, Abd-Aziz S, Bujang K, Hassan MA. 2010. Bioconversion of Sago Residu into Value Added Products. Afri J Biotechnol. 9:2016-2021. Bahagiawati, Rizjaani H, Sibuea AK. 2009. Toksisitas Isolat Bacillus

thuringiensis yang mengandung Gen cry 1A Terhadap Hama Penggerek Batang Jagung, Ostrinia furnacalis Guenee. J Biol Ind. 6(1):97-105.

Bakri Y, Ammouneh H, El-Khouri S, Harba M, Thonart P. 2012. Isolation and Identification of A New Bacillus strain for Amylase Production. Research in Biotechnol, 3(6): 51-58.

Benoit LG, Wilson GR, Baugh CL. 1990. Fermentation During Growth and Sporulation of Bacillus thuringiensis HD-1. Lett Appl Microbiol. 10 :15-16. Bernhard K, Utz R. 1993. Production of Bacillus thuringiensis Insecticide for

Experimental and Commercial Uses. Di dalam: Enwistle PF, Cory JS, Bailey MJ, Higgs S, editor. Bacillus thuringiensis An Enviromental Biopesticide : Theory and Practice. Chichester : John Wiley and Son : 255-266.

Barber I. 2004. Characterization of Bacillus Species by Numerical Analysis of their SDS-PAGE Protein Profiles. J Cell and Molecular Biol. 3: 33-37.

Beuchat LR. 1977. Functional and electrophoresis characteristics of succinylated peanut flour protein. J Agric Food Chem. 25: 258–261.

Bhargav S, Panda BP, Ali M, Javed S. 2008. Solid-state Fermentation: An Overview. Chem Biochem Eng. 22(1):49-70.

Bouillaut L, Ramarao N, Buisson C, Gilois N, Gohar M, Lereclus D, LeRoux CN. 2005. FlhA Influences Bacillus thuringiensis PlcRRegulated Gene Transcription, Protein Production and Virulence. Appl Environ Microbiol. 71: 8903.

Bucher GE. 1981. Identification of Bactery Found in Insect, pp 7-33. Di dalam HD Burges, editor. Microbial Control of Pest and Plant Diseases 1970-1980. New York: Academic Pr.

Burgerjon A, Martouret D. 1971. Determination and Significance of The Host Spectrum of Bacillus thuringiensis. Di dalam Burges HD and Hussey NW, editor. Microbial Control of Insect and Mites. London: Academic Press. hlm. 305-322.

Capablo DMF, Valisente FH, Moraes IO, Pelizer LH. 2001. Solid-state Fermentation of Bacillus thuringiensis tolworthi to Control fall armyworm in Maize. J. Biotechnol. 2 : 112-115.

Centikaya FT. 2002. Isolation of Bacillus thuringiensis and Investigation of Its Crystal Protein Genes. [disertasi]. Izumir, Turkey: Izmir Institute of Technology.

Damgaard PH, Granum PE, Bresciani J, Torregrossa MV, Eilengerg J, Valentino L. 1997. Characterization of Bacillus thuringiensis isolated from infections in burn wounds. FEMS Immunol. Med Microbiol. 18:47-57.

Devi PSV, Ravinder T, Jaidev C. 2005. Cost-effective production of Bacillus thuringiensis by solid-state fermentation. J. Invertebrate Pathol. 88 : 163-168. Devi PSV, Rao MLN. 2005. Tailoring Production Technology: Bacillus

thuringiensis (Bt) for Localized Production. Tailoring Biotechnol,

1(2):107-120.

Dono D, Syafri I, Idar, Prijono D, Ikha M. 2010. Status dan mekanisme resistensi biokimia Crocidolomia pavonana (F.) (Lepidoptera: Crambidae) terhadap insektisida organofosfat serta kepekaan terhadap insektisida botani ekstrak biji Barringtonia asiatica.J Entomol. 7(1): 9-27.

Driss F, Kallassy-Awad M, Zouari N, Jaoua. 2005. Molecular characterization of a novel chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. J Appl Microbiol. 99:945–953.

61 Dulmage HT, Correa JA, Morales GG. 1990. Potential for Improved Formulation of B. thuringiensis israelensis through Standarization and Fermentation Development. Di dalam: H de Barjac and Sutherland DJ, editor. Bacterial control of Mosquitoes and Blackflies : Biochemistry, Genetics and Application of B. thuringiensis and B. sphaericus. New Jersey: Rutgers University Press. Dulmage T, Rhodes, 1971. Production of Pathogen in Artificial Media. Di dalam:

Burgess HD dan Hussey NW. Microbial Control of Pest and Plant Diseases

1970-1980. New York : Academic Pr. 507-540.

Dunkle RL, Shasha BS. 1989. Response of starch encapsulated Bacillus thuringiensis containing UV screens to sunlight. Environ Entomol. 18:1035- 1041.

Dunn M.J. 1989. Determination of total Protein Concentration. di dalam : Protein Purification Methods. Harris, E.L.V. dan S. Angal (eds.). IRL Press, Oxford, England.

Ellis JA.2004. Commonly Asked Questions About B. thuringiensis k (Bacillus

thuringiensis var. kurstaki). Exotic Insect Education Coordinator Departement of Entomology, Purdue University.

Eswarapriya B, Gopalsamy B, Kameswari B, Meera R, Devi P. 2010. Insecticidal Activity of Bacillus thuringiensis IBT- 15Strain against Plutella xylostella. J of PharmTech Research. 2 (3): 2048-2053.

Farrera RR, Perez-Guevara F, de la Torre M. 1998. Carbon:Nitrogen Ratio Interacts with Initial Concentration of Total Solids on Insecticid Crystal Protein and Spore Production in Bacillus thuringiensis HD-73. Appl Microb Biotechnol.

49: 758-765.

Federici BA, Park Hyun-Woo, Bideshi DK. 2010. Overview of The Basic Biology of Bacillus thuringiensis With Emphasis on Genetic Engineering of Bacterial Larvicides for Mosquito Control. Toxinol J. 3 :83-100.

Foda MS, Fawkia M, El-Beih M, Maysa E, Nora NA. El-Gamal. 2010. Physiological Formation of Mosquitocidal Toxin by a novel Bacillus thuringiensis isolate under Solid State Fermentation. J. Life Sci 7: 144-152. Foda MS, Salama HS, Selim M. 1985. Factors Affecting the Growth Physiology

of Bacillus thuringiensis. Appl Microb Biotechnol. 22: 50-52.

Frazier WC, Westhoff DC. 1988. Food Microbiology. McGraw-Hill book Company, New York.

Frutos R, Rang C, Royer M, 1999. Managing insect resistance to plants producing

Bacillus thuringiensis toxins. Critical Rev in Biotechnol. 19: 227-276.

Gill SS, Cowles EA and Pietrantonio PV. 1992. The Mode of Action of Bacillus thuringiensis Enditoxin. Annu Rev Entomol. 37 : 615-636.

Hanafiah K, A. 2005. Rancangan Percobaan: Teori dan Aplikasi. Jakarta, Rajawali Pers. Edisi kedua.

Hasbullah. 2001. Teknologi Tepat Guna Agroindustri Kecil Sumatera Barat. Dewan Ilmu Pengetahuan, Teknologi dan Industri Sumatera Barat.

Hayami Y, Kawagoe T. 1993. The Agragian Origin of Commerce and Industry (a Study of Peasant Marketing in Indonesia). St Martin’sPress.

Kaur A, Kaur M, Samyal ML, Ahmed Z. 2012. Isolation, Characterization and Identification of Bacterial Strain Producing Amylase. J Microbiol Biotech Res. 2 (4):573-579.

Laemmli UK, 1970, Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature Int J Sci. 227: 680 – 685.

Ling L, Xianzhao K, Hao Y, Danni W. 2012. Characterization of extracellular cellulose-degrading enzymes from Bacillus thuringiensis strains. J Biotechnol..

15(3):1-5.

Lopez-Meza JE, Ibarra JE. 1996. Characterization of a novel strain of Bacillus thuringiensis, App Environ Microbiol. 62:1306-1310.

Maheswaran S, Sreeramanan S, Reena CM, Marimuthu K, Xavier R. 2010. Occurrence of Bacillus thuringiensis in faeces of herbivorous farm animals. Afr J Biotechnol. 9(47) : 8013-8019.

Mangunwidjaja D dan Suryani A. 1994. Teknologi Bioproses. Penerbit Swadaya. Jakarta..

Marchesi JR, Sato TT, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, Dymock D, Wade WG. 1998. Design and Evaluation of Useful Bacterium Specific PCR Primers that Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA. App Environ Microbiol

64 (2): 795-799.

Martin PAW, Gundersen-Rindal DE, Blackburn MB. 2010. Distribution of phenotypes among Bacillus thuringiensis strains. Syst App Microbiol. 33(4):204-8.

Marzban R. 2012. Investigation on The Suitable isolate and Medium for Production of Bacillus thuringiensis. J Biopest. 5(2):144-147.

63 Matsuko T, Minomi A, Iwasaki N, Majima T, Nishimura S, Lee YC. 2005. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format.

Anal Biochem. 339, 69-72.

McCleary BV. 2001. Analysis of Feed Enzimes. Di dalam: Bedford MR dan Partridge GG, Editor. Enzymes in Farm Animal Nutrition. New York (US): Cabi Publishing.

Muharsini S, Wardhana AH, Ruzaam H, Amirhusein B. 2003. Karakteristik Isolat

Bacillus thuringiensis dari Beberapa Daerah di Jawa dan Sulawesi Selatan untuk Kontrol Biologi Lalat Myasis Chrysomya bezziana. JITV 4(8).

Mumigati, Raghunathan.1990. Infuence of Media Composition on The Production of Deltaendotxin by Bacillus thuringiensis var. israelensis. J Invertebr Pathol.

55:147-155.

Nelly A. 2012. Penentuan Rasio C/N dan Pengembangan Produksi Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis Menggunakan Media Kultivasi Limbah Industri Tahu [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Neppl CC. 2000. Management of Resistance to Bacillus thuringiensis toxins. [tesis], Chicago: University of Chicago.

Norris JR. 1971. The Protein Crystal Toxin of Bacillus thuringiensis : Biosynthesis and Physical Structure. Di dalam: H.D. Burges dan N.W. Hussey, editor. Microbial Control of Insect and Mites. New York : Academic Pr. 229- 246.

Patel HK, Jani JJ, Vyas HG. 2009. Isolation and Characterization of Lepidopteran Specific Bacillus thuringiensis. IJIB. 6 (3) :121-126.

Prastowo NA. 2008. Air Kelapa Sebagai Air Mineral Alami

http://www.kalbe.co.id/index.php?mn=news&tipe=detail&detail=19513 [18 Oktober 2011]

Preston NW, and Morrel A. 1962. Reproducible Results with the Gram Stain. J Pathol Bacteriol. 84:241.

Quinlan, Lisansky. 1985. Microbial Insectisides, pp 233-254. Di dalam Dellweg, editor. Biotechnology vol 3. Weinhein: Verlag Chemist.

Rahayuningsih M. 2003. Toksisitas dan Perbedaaan Aktivitas Dipterosida Bioinsektisida Bacillus thuringiensis var. israelensis Tipe Liar dan Mutan pada berbagai Formulasi Media dan Kondisi Kultivasi. [disertasi]. Bogor: Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Rahman A. 1990. Teknologi Fermentasi. Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor.

Renganathan K, Rathinam X, Danial M, Subramaniam S. 2011. Quick isolation and characterization of novel Bacillus thuringiensis strains from mosquito breeding sites in Malaysia. J Food Agric. 23 (01): 17-26.

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning. A Manual Laboratory. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Sasmitaloka KS. 2014. Produksi Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis

Menggunakan Hasil Samping Agroindustri pada Kultivasi Media Padat [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, Zeigler DR, Dean DH. 1998. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Protein.

Microbiol Mol Biol Rev. 62:775-806.

Scragg, AH. 1991. Bioreactors in Biotechnology, A Practical Approach. Ellis Horword, New York.

Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, Nampoothiri KM, Soccol CR, Pandey A. 2006. Alpha-amylases from Microbial Source : an Overview on Recent Developments. Food Technol Biotechnol. 44(20): 173-184.

Stackebrandt E, Goebel BM. 1994. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J Syst Evol Microb 44:846-849.

Stahly DP, Andrews RE, Ayousten A. 1992. The Genus Bacillus Insect Pathogens, pp. 1697-1745. Di dalam: Balows A, Truper HG, Drowkin M, Horder W, Schleifer KH, editor. The Prokaryotes Spiringerverlag, New York.

Stanbury PF dan Whitaker A. 1984. Principles of Fermentation Technology. Oxford: Pergamon Press.

Susanti L, Blondin ChP. 2013. Pengaruh Ketinggian Habitat Kelapa (Cocos nucifera) Terhadap Pengembang biakan Bacillus thuringiensis H-14 dan Toksisitasnya Terhadap Jentik (Anopheles aconitus). Media Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. 23(1)

Syaefullah S. 1990. Studi Karakteristik Glukomanan dan Sumber "indigenous"

Iles-Iles (A. onchopyllus) dengan Variasi Proses Pengeringan dan Basis Perendaman [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Syamsu K, Rahayuningsih M, Yulianti R. 2002. Pengaruh Aerasi Terhadap Produksi Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis susp. israelensis pada Bioreaktor Tanki berpengaduk dan Bioreaktor Kolom Gelembung. J Tek Indust Pert. 11(3):92-100

65 Tamura K. 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likehood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.

Mol Biol and Evol 28:2731-2739.

Tirado-Montiel M, Tyagi RD, Valero JR. 2001. Wastewater Treatment Sludge as Raw Material for The Production of Bacillus thuringiensis Based Biopesticides. Water Research. New York. 35:3807-3816.

Tokcaer Z. 2003. Response Surface Optimization of Bacillus thuringiensis israelensis Fermenta-tion [Thesis]. The Middle East Technical University. Tyagi RD, Sikati F V, Barnabe S, Vidyarthi AS, Valéro JR, Surampalli RY. 2002.

Simultaneous production of biopesticide and alkaline proteases by Bacillus thuringiensis using sewage sludge as a raw material. Water Sci Technol.

46(10):247-54.

Tyrell DJ, Bulla LE, Andrews RE. Kramer KJ, Davidson LI, Nordin P. 1981. Comparative Biochemistry of Entomocidal Parasporal Crystals of Selected

Bacillus thuringiensis Strains. J Bacteriol. 1052-1062.

USEPA, Meeting summary: EPA-USDA Bt crop insect resistance management workshop, 1999b. (http://www.epa.gov/oppbppd1/biopesticides/summary 826.htm)

Valicente FH, Mourao AHC. 2008. Use of By-Products Rich in Carbon and Nitrogen as a Nutrient Source to Produce Bacillus thuringiensis (Berliner)- Based Biopesticide. J Neotropical Entomol. 37(6) : 702-708.

Volk S A, Whcele MF. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.

Van Frankenhuyzen K. (1993) The challenge of Bacillus thuringiensis in Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide: Theory and Practice, edited by Entwistle PF, Cory JS, Bailey MJ, Higgs S. John Wiley & Sons. Chichester,UK. p. 1-35.

Wang DIC, Cooney CL, Dunnill P, Humprey AE, Lilly MD. 1979. Fermentation and Enzyme Technology. New York : John Wiley and Sons.

Wenge F, Methews AF. 1999. Lactic acid production from lactose by

Lactobacillus plantarum kinetic model and effects of pH, substrate, and oxygen. J Biochem Eng 3: 163−170.

Weisburg WG, Barus SM, Pelletier DA, Lene DJ. 1990. 16S Ribosomal DNA Amplifikation for Phylogenetic Study. J of Microb 173 (2): 697-703.

Wilson K, Walker J. 2000. Principles and Techniques of Techniques of Practical Biochemistry. Fifth ed. Cambridge University Press.

Woese CR.1987. Bacterial Evolution. Microb Rev 51(2): 221-271.

Xavier R, Nagarathinam P, Gopalakrishnan MV, Jayaraman K. 2007. Isolation of Lepidopteran Active Native Bacillus thuringiensis Strains through PCR Panning. Asia Pacific J Mol Biol Biotechnol. 15: 61.

Zhang W, Qiu L, Gong A, Cao Y, Wang Bin. 2013. Solid-state Fermentation of Kitchen Waste for Productio of Bacillus thuringiensis-based Biopesticide.

Bioresources. 8(1):1124-1135.

Zhuang L, Zhou S, Wang Y, Liu Z, Xu R. 2011. Cost-effective production of

Bacillus thuringiensis biopesticides by solid-state fermentation using wastewater sludge: Effects of heavy metals. J Bioresource Technol. 102 : 4820-4826.

67 Lampiran 1 Prosedur analisis karakterisasi dan identifikasi mikroba

a. Bentuk dan Ukuran (Metode Scanning electron microscope)

Analisa untuk melihat morfologi sel dan kristal bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan Scanning electron microscope (SEM). Analisa dilakukan dengan menggunakan SEM Phenom proX. Sampel dikeringkan kemudian diletakan pada plat sampel, selanjutnya dilapisi dengan lapisan emas setebal 48 m. Sampel yang telah dilapisi diamati menggunakan SEM pada perbesaran 5 000 kali hingga 20 000 kali.

b. Uji Motilitas Metoda Tetes Menggantung (Eswarapriya et al. 2010)

Bersihkan kaca objek dan kaca penutup. Vaselin dioleskan pada sekitar tepian kaca penutup. Contoh diteteskan pada kaca penutup lalu tempelkan pada kaca penutup. Putar slide dengan hati-hati untuk membuat tetesan tergantung. Selanjutnya pengamatan pergerakan mikroba dilakukan menggunakan mikroskop.

c. Uji Motilitas Metoda Tusuk Agar

Masukan nutrient agar yang sudah larut kedalam tabung reaksi, kemudian disterilisasi. Setelah agar membeku secara aseptis bakteri diinokulasikan ke dalam media nutrient agar dengan cara ditusuk. Selanjutnya kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30oC. Sebagai control diinkubasi media yang ditusuk tanpa bakteri. Gerak bakteri dapat dilihat dari kekeruhan pada media tidak terbatas pada pada arah inokulasi. Sedangkan bakteri yang tidak motil hanya tumbuh pada bagian tusuk inokulasi.

d. Pewarnaan Gram (Preston dan Morel 1962)

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan etanol 70%. Secara aseptis suspensi bakteri diambil menggunakan ose dan letakan pada kaca obyek. Campuran tersebut diratakan di tengah permukaan kaca. Preparat tersebut dikering anginkan hingga membentuk noda. Setelah kering preparat difiksasi dengan cara memanaskan diatas nyala api. Setelah dingin ditetesi 2 – 3 tetes pewarna primer yaitu kristal violet dan diamkan selama 1 menit. Zat warna tersebut dibilas dengan air yang mengalir. Air yang tersisa pada spesimen diserap dengan kertas serap. Tetesi dengan larutan iodium dan dibiarkan selama 2 menit, kemudian dicuci dengan air yang mengalir dan kering anginkan. Pemucat warna digunakan etanol 95% selama 30 detik dan dicuci dengan air lalu kering anginkan, selanjutnya pewarna safranin diberikan dan didiamkan selama 30 detik, dengan air lalu kering anginkan. Preparat selanjutnya diamati di bawah mikroskop (Carl Zeiss). Bakteri Gram positif akan tampak berwarna berwarna biru dan Gram negatif akan terlihat berwarna merah.

e. Aktivitas Amilolitik (Kaur et al. 2012)

Kemampuan amilolitik mikroba dilihat dengan cara menumbuhkan isolat pada media starch agar. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah inkubasi diberi larutan Iodium selama 30 detik. zona bening yang terbentuk disekitar koloni bakteri menunjukkan bakteri bersifat amilolitik

f. Profil Protein dengan Teknik SDS-PAGE (Laemmli 1970)

Berat molekul protein diukur menggunakan metode elektroforesis. Teknik pemisahan protein dengan elektroforesis dilakukan dalam tiga tahap. Pertama mengekstrak protein dari sample. Tahap kedua pembuatan gel elektroforesis dengan menggunakan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Tahap ketiga adalah pemisahan protein dengan teknik elektroforesis, yang dilanjutkan dengan pendeteksian pita protein yang terbentuk

Ekstrak Protein dari Contoh

Kristal dipisahkan dari cairan kultivasi. Cairan kultivasi disentrifugasi pada kecepatan 10 000 g selama 20 menit dan dicuci dengan NaCl 1 N dilanjutkan dengan aquades steril. Kristal kemudian diisolasi dari spora dengan menggunakan teknik sentrifugasi gradien densitas menggunakan urografin (20 % - 50 %) dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 20 000 rpm selama 60 menit. Spora dari

B. thuringiensis akan tertinggal di dasar tabung sentrifusi sedangkan kristal akan ada pada lapisan atas. Dengan hati-hati kristal dipisahkan dan kemudian dicuci dengan aquades steril dan disimpan dalam freezer bersuhu -200C. Protein dalam kristal diukur dengan metode Lowry, kemudian dipekatkan dengan PEG 8 000 (bila perlu). Sebanyak 10 – 20 L kristal dengan konsentrasi protein sama disuntikan pada slab gel poliakrilamid 15 % pada mini protein SDS PAGE Kit.

Pembuatan Gel Elektroforesis.

Cetakan gel (mini slab gel) dibuat dari dua lempeng kaca yang direkatkan dan diberi pemisah (spacer). Sebanyak 1.5 mL larutan gel pemisah ditambahkan 3 L TEMED (tetrametilen-etilenadiamin), diaduk rata dan dipipetkan pada bagian dasar kaca pencetak gel yang telah dipasang di atas lempeng kaca membentuk garis lurus. Setelah larutan mengeras, sisa larutan gel pemisah ditambah 5 L atau 10 mL TEMED dan dipipetkan perlahan-lahan ke dalam cetakan dan dijaga agar tidak terbentuk gelembung udara. Akuades dipipet untuk membentuk tepi gel yang rata dan untuk membasahi gel agar tidak kering. Pemasukan gel ke dalam cetakan harus dilakukan secara cepat, karena adanya TEMED gel akan cepat mengeras. Setelah gel pemisah membeku, akuades diserap dengan kertas saring dan larutan gel penahan dimasukan hingga batas atas cetakan. Sisir pencetak sumur dimasukan dan gel dibiarkan terpolimerisasi sempurna. Komposisi gel pemisah dan gel penahan dapat dilihat pada Tabel di bawah ini.

Pendeteksian pita protein

Setelah gel terpolimerisasi sempurna, sisir dan klip dilepas. Gel dipasang, buffer elektroforesis dimasukan dan alat elektroforesis dirangkai. Buffer elektroforesis komposisinya sebagai berikut : Glisis 192 mM, SDS 0.1 %, Tris base 24.8 mM. Sebelum dimasukan ke dalam sumur marker dan sampel ditambahkan buffer sampel (1:1) diinkubasi pada penangas air mendidih selama 1 menit. Komposisi buffer sampel adalah SDS 1 g, gliserol 50% 2 mL,

bromophenol blue 0.1 % 2 mL, Tris HCl 1 M 1.25 mL dan akuades sebanyak 10 mL. Volume sampel yang dimasukan ke dalam sumur sebanyak 10 – 20 L tergantung tebal tipisnya pita protein yang diinginkan. Elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 volt dan arus listrik 100 mA selama 90-120 menit hingga

bromophenol blue mencapai 1 cm di bawah gel. Gel hasil elektoforesis dilepas dari cetakan dan diukur jarak migrasi bromophenol blue. Gel tersebut dicelup dalam larutan pewarna (50 % metanol + 10% asam asetat + 0.06 % coomassei blue R-250) selama 24 jam sambil digoyang konstan. Kelebihan warna dibuang dengan merendam gel dalam larutan peluntur (5% methanol + 7.5% asam asetat) sampai diperoleh pita-pita protein yang berwarna biru dengan latar belakang jernih. Silver staining dilanjutkan bila pita pada gel tidak napak jelas.

Perhitungan Berat Molekul

Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker (standar protein) dengan log dari berat molekul marker yang telah diketahui. Standar protein yang dipergunakan adalah penanda protein LMW-SDS (Low Molecular Weight-Sodium Dodensil Sulfat). Penentuan BM sampel dihitung dari persamaan linier kurva standar LMW yang dapat dicari dari hubungan antara mobilitas elektroforetik (Rf) dengan BM sehingga dapat diperoleh persamaan regresi linier. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein yang diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein dan dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dapat dirumuskan sebagai berikut :

Komposisi gel pemisah dan gel penahan pada elektroporesis

Komposisi Gel pemisah 10%

poliakrilamid (mL)

Gel penahan 4 % Poliakrilamid (mL) Larutan stok akrilamid

(30%), akrilamid 29% (b/v) dan bisakrilamid 1% (b/v) 1.5 M Buffer Tris-Cl pH 8.8 0.5 M Buffer Tris-Cl pH 6.8 Akuades 10 % (b/v) SDS 10 % (b/v) APS 0.05 mL 3.3 2.5 - 4.1 0.1 0.1 0.01 0.67 - 1.25 3.075 0.05 0.05 0.005 Sumber : Laemmli (1970)

Dalam dokumen Proses Produksi Bioinsektisida Bacillus thuringiensis Isolat Lokal Menggunakan Limbah Agroindustri pada Kultivasi Media Padat. (Halaman 74-101)