Volume elusi (mL)
IV.8 Pemisahan spesi Ca B2 dengan metode CE
Eksplorasi lebih dalam terhadap spesi Ca merupakan suatu hal utama karena Ca salah satu unsur hara pokok bagi tanaman. Kandungan Ca dalam tanaman sekitar 0,1 – 2,0 % berat kering tanaman. Peranan Ca dalam tanaman sangat besar, terutama dalam pembentukan kayu, seperti pada manusia dan hewan pada pembentukan tulang (McLaughlin dan Wimmer, 1999). Kalsium juga merupakan bagian yang penting dalam signalling molecule yang terstimulasi oleh sinar merah, gravitasi, sentuhan, kejutan dingin atau hormon tertentu (White, 2001; 2004; Scrase-Field dan Knight, 2003; White and Broadley, 2003; Reddy, 2001; Kordyum, 2003; Sathyanarayanan dan Poovaiah, 2004) dan sensor (McCormack dan Braam 2003; Nayyar, 2003).
Sabnis dan McEuen (1986) telah mempelajari kemungkinan pengikatan Ca oleh protein floem Cucurbita maxima, Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita pepo. Dalam penelitian tersebut, protein dari cairan floem diinkubasi dengan 10 µL larutan 45CaCl2 10 mM lalu difraksinasi dalam kolom sephadex G-100. sebagai hasil penelitian sebagian kecil fraksi spesi Ca terdeteksi pada void volume (>100 kDa) yang berkorelasi positif dengan protein. Total Ca dalam floem 1 mM (40 mg/L). Menurut Sabnis dan McEuen, tingginya total Ca kemungkinan disebabkan oleh pelepasan tekanan turgor selama proses pengirisan. Konsekuensinya air dan ion-ion dari sekitar apoplastik dan simplastik mengalir ke tabung tapis. Sekitar dua pertiga total Ca terkomplekskan dengan ligan berberat
molekul rendah. Itoh dan Kang (1993) juga telah menyelidiki kemungkinan keberadaan kristal kalsium oksalat dalam dinding sel floem sekunder taxodiaceae.
Spesi Ca dalam cairan floem dapat dipisahkan dengan baik dengan menggunakan metode SEC namun kurang berhasil dengan metode QPNC PAGE. Oleh karen itu dicoba strategi pemisahan bidimensional lain yaitu menggunakan LC-MS/MS untuk spesi CaA2 sebagai spesi utama Ca dalam cairan floem. Hasil yang diharapkan adalah informasi tentang struktur molekul spesi Ca tersebut. Penelitian ini merupakan penelitian bersama dengan kelompok spesiasi Intitut ZCH di Pusat penelitian Jülich, Jerman. Namun penelitian bersama ini kurang berhasil karena beberapa hal, yaitu: (i) optimasi metode yang kurang optimal (terbatas oleh waktu), (ii) batas deteksi yang masih tinggi setelah pemisahan tahap kedua, (iii) proses prekonsentrasi kemungkinan menyebabkan terjadinya transformasi spesi sehingga tidak terdeteksi, dan (iv) adanya kontaminasi selama proses pemisahan-pendeteksian.
Berdasarkan pengalaman tersebut di atas, strategi pemisahan berikutnya adalah menggunakan elektroforesis kapiler dan spesi Ca yang akan dipisahkan adalah spesi CaB2 yang mempunyai kelimpahan relatif dan kandungan Ca yang tinggi. Sehingga tidak diperlukan proses prekonsentrasi. Pemilihan metoda CE untuk spesi CaB2 antara lain: (i) berat molekul spesi yang rendah ( di bawah 1350 Da) sangat sesuai untuk analisis CE, (ii) kemungkinan spesi aktif UV sehingga bisa dideteksi dengan detektor UV tanpa proses derivatisasi, (iii) analisis CE hanya memerlukan sampel dengan jumlah kecil (nanoliter), (iv) proses analisis cepat (dalam waktu kurang dari 15 menit), serta (v) optimasi metoda dengan berbagai variasi buffer, baik konsentrasi, komposisi dan pH, serta tegangan yang diaplikasikan dapat dilakukan dengan mudah sehingga dapat diperoleh hasil pemisahan yang sangat baik. Selain itu, Metode CE merupakan salah satu metode yang sangat berkembang saat ini karena kemampuannya memisahkan mulai dari biomolekul besar hingga ionik anorganik kecil, baik itu sebagai molekul netral, bermuatan positif maupun negatif. Jika dibandingkan dengan kromatografi cair, metode ini adalah metode yang lebih sederhana dan teknik pemisahan yang cepat
serta membutuhkan sampel dan pereaksi dalam jumlah yang sangat sedikit (nanoliter) serta biaya operasional yang relatif murah untuk penggantian kolom kapiler (Cornelis, dkk., 2003; Michalke, 2003a; Caruso, dkk., 2003).
Optimasi metode CE merupakan langkah awal yang penting dalam analisis spesiasi menggunakan CE. Optimasi kondisi pemisahan meliputi variasi penyangga, konsentrasi penyangga, pH penyangga, dan besarnya tegangan yang diaplikasikan. Hal ini dimaksudkan untuk menjaga agar tidak terjadi transformasi spesi selama proses pemisahan dan mendapatkan hasil pemisahan yang baik (Wang dkk., 2003).
Kondisi pemisahan sangat dipengaruhi oleh suhu. Pada tahap awal pemisahan dilakukan pada suhu ruang. Sebagai hasil penelitian, spesi tidak sabil dan kedapat-ulangan hasil pemisahan kurang baik. Hal ini menunjukkan adanya transformasi spesi. Aplikasi tegangan tinggi (15-30 kVolt) juga menyumbangkan panas yang besar sehingga semakin mempengaruhi kestabilan spesi. Oleh karena itu kolom kapiler didinginkan dengan menggunakan termostat. Idealnya, pemisahan dilakukan pada suhu 4 °C seperti pemisahan SEC dan QPNC PAGE. Namun suhu minimum yang dapat diaplikasi hanyalah 15 °C. Hal ini disebabkan aplikasi tegangan tinggi menimbulkan panas yang cukup tinggi dan termostat yang digunakan tidak mampu menurunkan suhu lebih rendah dari 15 °C. Walaupun demikian, kondisi operasional pada suhu 15 °C telah menghasilkan pemisahan yang sangat baik dengan kedapat-ulangan yang tinggi.
Salah satu teknik yang dikembangkan pada penelitian ini adalah penyuntikan sampel. Pada penyusunan program analisis CE, sebagai sampel, pertama disuntikkan fraksi SEC kemudian langsung diikuti penyuntikan BGE sebelum aplikasi tegangan (Tabel III.8). Hal ini dilakukan untuk mencegah kembalinya sampel pada saat pemberian tegangan. Teknik ini terbukti memberikan hasil analisis yang baik yaitu kedapat-ulangan yang tinggi dan garis dasar yang datar.
Tahap selanjutnya dalam optimasi metode CE adalah seleksi penyangga yang digunakan. Untuk mendapatkan pemisahan dengan resolusi yang baik serta sensitivitas deteksi yang tinggi, mobilitas BGE yang digunakan haruslah sedekat mungkin dengan mobilitas spesi yang akan dipisahkan. Pada uji pendahuluan telah dicoba berbagai penyangga, yaitu: Tris-HCl, asam borat, dan garam fosfat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebagian besar spesi terdeteksi sebagai senyawa anionik. Pada aplikasi tegangan positif, detektor terletak pada sisi katoda, sehingga yang terelusi paling awal adalah senyawa kationik, senyawa netral dan terakhir senyawa anionik. Pengamatan elektroferogram CE menunjukkan bahwa spesi yang terelusi pada waktu migrasi yang lama mempunyai kedapat-ulangan rendah. Oleh karena itu sistem campuran penyangga yang digunakan mengandung surfaktan kation sebagai pemodifikasi EOF (Chen dkk., 2001). Fungsi surfaktan dalam hal ini adalah sebagai pembalik arah alir EOF, sehingga dengan mengaplikasikan tegangan negatif, spesi anionik akan ikut bermigrasi dengan EOF menuju detektor pada ujung kutub anoda. Dengan demikian pemisahan dapat berlangsung dengan lebih cepat dan baik. Surfaktan kationik yang digunakan adalah CTAB. Gambar IV.34 menyajikan elektroferogram spesi Ca menggunakan 2 penyangga yang berbeda.
Berdasarkan Gambar IV.34 terlihat spesi Ca dapat terpisah dengan baik dengan menggunakan campuran penyangga Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB. Hal ini ditunjukkan dengan garis dasar yang rata dan puncak-puncak yang muncul dapat teridentifikasi dengan baik jika dibandingkan dengan pemisahan dalam campuran penyangga asam borat, walaupun dalam asam borat spesi terelusi lebih cepat dan pemisahan telah usai dalam lima menit. Oleh karena itu campuran penyangga Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB dipilih sebagai elektrolit latar (BGE) untuk pemisahan spesi LMM Ca dalam cairan floem.
Konsentrasi BGE dalam pemisahan metode CE mempengaruhi resolusi, sensitivitas, gangguan garis dasar dan waktu migrasi spesi. Oleh karena itu optimasi konsentrasi campuran penyangga merupakan tahap selanjutnya dalam optimasi metode CE. Variasi konsentrasi campuran penyangga telah disajikan
dalam Tabel. III.8. Seperti yang ditampilkan dalam Gambar IV.35, terdeteksi minimal ada 13 puncak dalam sampel.
Gambar IV. 34 Elektroferogram low molecular mass (LMM) spesi Ca dalam cairan floem Ricinus communis,L. pada pH 8.0 menggunakan BGE (a) 10 mM Na2HPO4/ 10 mM NaH2PO4/1.0 mM CTAB dan (b) 20 mM H3BO3/ 1.0 mM CTAB.
Secara umum terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi penyangga laju migrasi spesi semakin lambat. Hal ini karena peningkatan konsentrasi penyangga meningkatkan kekuatan ion dalam elektrolit yang menyebabkan penurunan EOF. Pada konsentrasi fosfat 10 mM, pemisahan hanya berlangsung 8,2 menit sedangkan pada konsentrasi fosfat 15 mM, 10,2 menit. Contoh lain, waktu migrasi Puncak 13 adalah 7,6 menit pada C1 yang bergeser menjadi 9,4 menit pada C4. Peningkatan konsentrasi fosfat hanya berpengaruh nyata pada resolusi puncak 11 dan 12. Pada konsentrasi fosfat 15 mM, resolusi Puncak 11-12 lebih baik sehingga Puncak 11 dapat dipisahkan dari Puncak 12 (Gambar IV.35. C3 dan C4). Sayangnya intensitas Puncak 6 melemah pada konsentrasi fosfat 15 mM.
Gambar IV. 35 Pengaruh variasi konsentrasi BGE I (Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB) pada pH 8,0. C1: 10/10/0.5, C2: 10/10/1.0, C3: 15/15/0.5, dan C4: 15/15/1.0
Konsentrasi surfaktan mempengaruhi profil puncak 7 dan 8 (Gambar IV. 35). Pada konsentrasi fosfat 10 mM, peningkatan konsentrasi CTAB sebesar 0,5 mM mempengaruhi profil puncak 7 dan 8, yaitu dari bentuk puncak ber-tailing menjadi puncak ber-fronting. Sedangkan pada konsentrasi fosfat 15 mM, puncak 7 dan 8 dapat terpisah dengan baik, peningkatan konsentrasi CTAB malah memperkecil resolusi. Ini menunjukkan kemungkinan terbentuknya misel pada konsentrasi CTAB 1,0 mM. Dengan demikian konsentrasi optimal CTAB untuk membalik arah EOF adalah 0,5 mM. Berdasarkan pertimbangan waktu migrasi, intensitas puncak, sensitivitas dan kedapat-ulangan semua puncak, komposisi C1, yaitu 10 mM Na2HPO4/ 10 mM NaH2PO4/ 0,5 mM CTAB ditetapkan sebagai konsentrasi optimal campuran penyangga yang digunakan untuk pemisahan spesi LMM Ca dalam cairan floem tanaman jarak.
Dalam elektroforesis kapiler, spesi ionik dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya. Kekuatan keasaman (pH) elektrolit latar mempengaruhi pemisahan spesi. Pemisahan sebaiknya dilakukan pada pH fisiologi cairan floem, yaitu pada
pH 8,0 untuk mempertahankan kestabilan spesi. Oleh karena itu, rentang pH larutan elektrolit yang dicoba adalah dari 7,5 – 9,0.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa setiap puncak yang muncul memberikan respon yang berbeda terhadap variasi pH tersebut (Gambar IV. 36). Sebagai contoh, pada pH 7,5 dan 8,6, peak 7 dan 8 dapat dipisahkan dengan baik walaupun waktu migrasi spesi meningkat dan kedapatulangan (reproducibility) waktu migrasi puncak 11/12 dan 13 tidak optimal. Pemisahan pada pH 8,0 secara keseluruhan memperlihatkan resolusi yang baik sedangkan pada kondisi basa (pH 9,0), terjadi gangguan pada puncak 11 dan 12, yang menunjukkan spesi tersebut tidak stabil pada pH 9,0. Berdasarkan pertimbangan waktu migrasi dan kedapatulangan waktu migrasi puncak, maka pH 8,0 merupakan pH optimal untuk pemisahan spesi LMM Ca dalam cairan floem. Hal ini menunjukkan bahwa pemisahan spesi Ca selayaknya dilakukan pada kondisi keasaman fisiologi cairan floem yaitu pH 8,0.
Gambar IV. 36 Pengaruh pH pada pemisahan LMM Ca. Kondisi pemisahan sesuai tabel 3. Konsentrasi BGE 10 mM Na2HPO4/ 10 mM NaH2PO4/ 0.5 mM CTAB.