Volume elusi (mL)
IV.4.6 Profil Elusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd setelah melalui kolom sephadex G-25 M
Gambar IV. 21 Profil distribusi protein thyroglobulin pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 1000 µL thyroglobulin 2,18 mg/mL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; Pendeteksian protein berdasarkan metode Bradford. Jumlah total protein yang terdeteksi 290,329 µg/mL dengan persen perolehan kembali 95,89%.
IV.4.6 Profil Elusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd setelah melalui kolom sephadex G-25 M
Untuk melihat kesesuaian profil elusi protein dan spesi logam yang dianalisis, digunakan kolom yang lebih kecil yaitu sephadex G-25. Keuntungan penggunaan kolom ini adalah fraksinasi dapat berlangsung lebih cepat (kurang lebih satu jam) sehingga analisis protein dapat dilakukan pada hari yang sama. Keuntungan lain
0 40 80 120 160 200 0 100 200 300 400 500 Volume elusi (mL) Ko nse n tras i prot ein (µg/m l)
adalah penggunaan kolom yang kecil hanya memerlukan sampel cairan floem relatif lebih sedikit dan faktor pengenceran sampel yang tidak terlalu besar. Profil elusi protein dalam cairan floem setelah melewati kolom sephadex G-25 ditampilkan pada Gambar IV. 22.
Gambar IV. 22 Profil distribusi protein cairan floem pada kolom sephadex G-25. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0; Pendeteksian protein berdasarkan metode Bradford. Jumlah total protein yang terdeteksi 144,536 µg/mL. Persen perolehan kembali protein 87,64%.
Pada Gambar IV. 22 terlihat bahwa protein terelusi sebagai satu puncak pada volume elusi 0,5 – 1,5 mL. Persen perolehan kembali protein tersebut setelah melalui kolom sephadex G-25 M sebesar 87,64 % dengan jumlah total protein sebesar 144,536 µg/mL. Untuk melihat korelasi profil elusi protein dan profil elusi unsur setelah melewati kolom, pada Gambar berikutnya daerah elusi protein yaitu pada volume elusi 0,5 – 1,5 mL akan diarsir. Profil protein yang sama juga telah dikemukakan oleh Krüger dkk. (2002). Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan profil protein cairan floem kecambah dan tanaman dewasa jarak.
-5 15 35 55 75 95 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Volume elusi (mL) K ons entras i protein (µg/m L )
Pada Gambar IV. 23 terlihat bahwa secara keseluruhan hanya terdapat dua puncak yaitu spesi utama MgB2 dan spesi MgB3. Spesi MgB1 tidak dapat dipisahkan dari spesi MgB2 mengingat kecilnya kelimpahan relatif spesi tersebut. Jika dibandingkan puncak pertama spesi Mg sebelum dan sesudah destruksi, terlihat puncak tersebut mulai muncul pada volume elusi 0,9 mL sebelum destruksi dan 1,2 mL setelah destruksi. Pada kolom kecil seperti sephadex G-25 yang digunakan, perbedaan volume elusi dalam satuan 0,1 mL dapat menunjukkan rentang berat molekul yang sangat besar, terutama pada volume elusi 0,5 – 1,5 mL.
Gambar IV. 23 Profil distribusi Mg pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. MgB1 kemungkinan spesi Mg yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.
Penghitungan total konsentrasi dan kelimpahan relatif spesi Mg pada daerah serapan 0,9-1,2 mL pada pemisahan sebelum destruksi menunjukkan kemungkinan terdapatnya spesi MgB1 yang kemudian terdestruksi setelah uji
0 40 80 120 160 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Volume elusi (mL) Konsentrasi/fraksi (mg/L)
(a) Mg sebelum destruksi (b) Mg setelah destruksi
MgB1
MgB3
proteinase. Hasil penelitian ini bersesuain dan menguatkan penemuan spesi Mg dalam cairan floem yang dipisahkan dengan menggunakan kolom sephadex G-50 dimana ditemukan juga 3 spesi Mg dengan profil sebaran kelimpahan yang tidak berbeda jauh. Sehingga dengan demikian dapat dikatakan bahwa spesi MgB1, MgB2, dan MgB3 yang terdeteksi dengan menggunakan kolom sephadex G-25 bersesuaian dengan berturut-turut spesi MgA1, MgA2, dan MgA3 yang ditemukan setelah pemisahan dengan kolom sephadex G-50.
Pada Gambar IV. 24 ditampilkan profil distribusi Ca pada kolom sephadex G-25. Terdeteksi hanya dua spesi Ca, yang diberi notasi sebagai spesi CaB1 da CaB2. Spesi CaB1 terdeteksi pada daerah arsiran, yang menunjukkan adanya kemungkinan spesi CaB1 berasosiasi dengan polipeptida /protein yang mana spesi ini terdestruksi setelah uji proteinase. Kemungkinan pengikatan kalsium oleh protein telah banyak dibahas. Kalmodulin merupakan salah satu protein kecil yang mengikat Ca. Pengikatan tersebut mengubah bentuk kalmodulin sedemikian rupa sehingga kemudian Kalmodulin dapat mengaktifkan beberapa enzim (Salisbury dan Ross, 1995; Zhang dan Lu, 2003).
Adapun spesi CaB2 kemungkinan akumulasi dari spesi CaA2 dan CaA3 berdasarkan perhitungan kelimpahan relatifnya. Interpretasi ini juga didukung berdasarkan data berat molekul relatif spesi CaA2 dan CaA3 (kurang dari 1350 Da) yang tidak dapat dipisahkan dengan menggunakan kolom sephadex G-25.
Pada Gambar IV. 25 ditampilkan profil elusi Mn pada kolom sephadex G-25 M. Terdeteksi secara nyata dua spesi Mn yaitu MnB1 dan MnB2, dimana sebagian spesi MnB1 terdestruksi setelah uji proteinase K. Profil elusi Mn berupa tailing setelah destruksi yang pada akhir elusi menunjukkan dengan kuat profil elusi ion Mn2+ sebagai hasil destruksi sebagian spesi MnB1. Jika diperhatikan tingginya kelimpahan relatif spesi MnB1 yang dapat mencapai 16%, diperkirakan MnB1 merupakan akumulasi spesi MnA1 dan sebagian spesi MnA2. Seperti halnya Ca,
Spesi MnB2 kemungkinan merupakan akumulasi dari sebagian spesi MnA2 dan MnA3.
Gambar IV. 24 Profil distribusi Ca pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. CaB1 kemungkinan spesi Ca yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.
Van Goor dan Wiersma (1976) telah meneliti bentuk kimiawi Mn dan Zn dalam cairan floem tanaman jarak yang berusia 2 bulan. Penelitian ini menggunakan isotop 54Mn dan 65Zn yang dicampurkan ke dalam larutan nutrisi. Pemisahan dilakukan pada kolom sephadex G-10, G15 dan G-25 menggunakan buffer Tris-HCl pH 8,2. Isotop 54Mn dan 65Zn dalam fraksi dideteksi menggunakan pencacah gamma. Hasil penelitiannya menunjukkan Mn muncul dalam dua bentuk, yaitu sebagai kation Mn dan senyawaan organik dengan berat molekul 1-5 kDa. Informasi ini mendukung hasil penelitian yang diperoleh, dimana terdeteksi dua spesi Mn dengan profil elusi yang mirip.
0 10 20 30 40 50 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Volume elusi (mL) K ons en tr as i/f ra k si (m
g/L) (a) Ca sebelum destruksi
(b) Ca setelah destruksi
CaB1
Gambar IV. 25 Profil distribusi Mn pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Sebagian spesi MnB1 kemungkinan spesi Mn yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0;
Krüger dkk.(2002) telah melakukan pemisahan spesi Zn dalam cairan floem kecambah jarak menggunakan kolom NAP-5 dan fasa gerak MES (volume elusi 0,5 mL). Dalam penelitian tersebut Zn terdeteksi sebagai satu spesi pada fraksi dengan berat molekul rendah. Profil elusi Zn tersebut bersesuaian dengan profil elusi sukrosa dalam cairan floem kecambah jarak.
Pada penelitian ini (Gambar IV. 26) terdeteksi 3 spesi Zn yaitu ZnB1, ZnB2 dan ZnB3 dengan kelimpahan relatif berturut-turut 4-5 %, 9-11%, dan 83-86%. Pendeteksian ketiga spesi Zn ini menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan telah berhasil memisahkan dan mendiferensiasikan spesi Zn yang dideteksi oleh Krüger dkk menjadi 3 spesi yang berbeda berdasarkan berat molekulnya.
0 100 200 300 400 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Volume elusi (mL) Ko nsen tr a si/ frak si (mg /L)
(a) Mn sebelum destruksi (b) Mn setelah destruksi
MnB2
Gambar IV. 26 Profil distribusi Zn pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0;
Pada pemisahan sebelumnya dengan menggunakan kolom sephadex G-50 SF juga ditemukan tiga spesi Zn dengan kelimpahan yang relatif sama. Hal ini menunjukkan adanya kemungkinan bahwa spesi ZnB1 merupakan ZnA1, ZnB2 serta ZnB3 identik dengan ZnA2 dan ZnA3. Walaupun spesi ZnB1 dan ZnB2 berada pada daerah arsiran elusi protein, tidak teramati perbedaan profil elusi sebelum dan sesudah destruksi. Hal ini menunjukkan bahwa spesi ZnB1 dan ZnB2 tidak berasosiasi dengan polipeptida atau protein. Hipotesa ini mendukung pernyataan Krüger dkk (2002), dimana sebagian kecil fraksi Zn kemungkinan berasosiasi dengan ligan yang lebih besar dibanding sukrosa. Van Goor dan Wiersma (1976) juga mendeteksi Zn sebagai satu spesi yang kemungkinan berasosiasi dengan senyawaan organik. Menurut Van Goor dan Wiersma spesi tersebut bermuatan negatif.
Gambar IV. 27 memperlihatkan profil elusi Mo pada kolom sephadex G-25 M. Terdeteksi dua spesi Mo yaitu MoB1 dan MoB2. berdasarkan kelimpahan relatifnya, kemungkinan spesi MoB1 merupakan akumulasi dari spesi MoA1 dan
0 1000 2000 3000 4000 5000 0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 Volume elusi (mL) Kon sen trasi/frak si (µg /L)
(a) Zn sebelum destruksi (b) Zn setelah destruksi
ZnB2
ZnB1
sebagian spesi MoA2, sedangkan spesi MoB2 merupakan sebagian lain dari spesi MoA2.
Gambar IV. 27 Profil distribusi Mo pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. MoB1 kemungkinan spesi Mg yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0;
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa spesi MoA2 kemungkinan terdiri dari beberapa spesi Mo yang berbeda dengan berat molekul kecil dari 1000 Da. Spesi ini kemungkinan ada yang berikatan dengan polipeptida/protein seperti yang ditunjukkan pada Gambar IV. 27, dimana spesi tersebut terdestruksi setelah uji proteinase dan ada yang tidak berasosiasi dengan polipeptida/protein. Profil tailing pada akhir elusi setelah destruksi dengan proteinase K, menunjukkan meningkatnya jumlah Mo dalam bentuk kation, memperkuat dugaan bahwa Mo dalam spesi MoB1 terdestruksi menjadi Mo ionik.
Profil elusi Cd pada kolom sephadex G-25 M sebelum destruksi dengan proteinase K hanya menampilkan satu puncak lebar pada volume elusi 0,8 – 2,2
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 Volume elusi (mL) Konsentrasi/ fraksi (µ g/L )
(a) Mo sebelum destruksi (b) Mo setelah destruksi
MoB2
mL yang diberi notasi CdB1 dengan konsentrasi maksimum pada volume elusi 1,2 mL (Gambar IV. 28). Jika dibandingkan dengan pemisahan yang dilakukan pada kolom sephadex G-50, ada kemungkinan bahwa spesi CdB1 merupakan akumulasi dari semua spesi yang terdeteksi pada kolom G-50 SF. Pertanyaan yang muncul adalah mengapa hanya muncul satu puncak Cd setelah pemisahan dengan kolom Sephadex G-25 M sedangkan pemisahan dengan kolom sephadex G-50 SF ada lima spesi yang terdeteksi. Setelah mengamati dengan seksama profil elusi kelimpahan relatif yang kemudian divisualisasikan pada Gambar IV. 29 terlihat dengan jelas bahwa sebaran Cd membentuk suatu puncak yang bersesuaian dengan puncak CdB1.
Gambar IV. 28 Profil distribusi Cd pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Sebagian spesi CdB1 kemungkinan spesi Cd yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 Volume elusi (mL) Kon sentrasi/fraks i (µg /L)
(a) Cd sebelum destruksi (b) Cd setelah destruksi
Gambar IV. 29 Profil distribusi kelimpahan Cd pada kolom sephadex G-50.
Profil elusi spesi CdB1 berkorelasi positif dengan profil elusi protein dalam cairan floem. Setelah uji proteinase K, terlihat bahwa spesi CdB1 tereduksi yang menunjukkan bahwa sebagian spesi CdB1 yang berada pada daerah arsiran kemungkinan berasosiasi dengan protein. Hal ini diperkuat dengan terbentuknya ekor (tailing) pada akhir elusi yang menunjukkan meningkatnya jumlah kation Cd setelah destruksi dibandingkan sebelum destruksi.
IV.5 Pemisahan spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd dalam cairan floem