TINJAUAN PUSTAKA
2.6 Teknik Pemisahan
Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam satu golongan (Muldja, 1995).
2.6.1 Ekstraksi
Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling sederhana adalah ekstraksi dingin (dalam labu besar berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil gilingan diekstraksi pada suhu kamar secara berturut-turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi. Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai. Penggunaan pelarut dengan peningkatan kepolaran secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan alam berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya) dalam ektraksi. Ekstraksi dingin memungkinkan banyak senyawa terekstraksi, meskipun beberapa senyawa memiliki kelarutan terbatas dalam pelarut ekstraksi pada suhu kamar (Heinrich et al, 2009).
Beberapa metode ekstraksi dapat digunakan untuk mengekstrak suatu konstituen dalam suatu bahan tanaman, yang diantaranya adalah maserasi, perkolasi, ekstraksi sokletasi, ekstraksi pelarut bertekanan, ekstraksi dengan refluks, dan destilasi uap.Dalam ekstraksi padat-cair, bahan tanaman ditempatkan dalam sebuah wadah, dan dibiarkan terjadi kontak dengan pelarut. Proses yang terjadi dari seluruh proses dinamis tersebut dapat diuraikan menjadi beberapa tahap, yaitu tahap pertama pelarut akan berdifusi ke dalam sel, kemudian pelarut akan melarutkan metabolit, dan pada
proses akhir pelarut akan berdifusi keluat dari sel bersama dengan metabolit (Sarker, 2007).
Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat, biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1996).
2.6.2 Partisi
Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak.Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya meningkat.
Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap:
1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan organik
2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich et al, 2009).
2.6.3 Hidrolisa
Prosedur yang digunakan untuk hidrolisis asam dari flavonoid glikosida adalah, sebanyak 2 mg sampel flavonoid glikosida dicampur dengan asam klorida 6% sebanyak 5 ml dengan jumlah metanol yang sangat sedikit pada sampel untuk membuat proses hidrolisis menjadi sempurna. Larutan dipanaskan selama 45 menit lalu didinginkan, kemudian ekstrak sepenuhnya dilarutkan dengan eter. Penguapan dari larutan akan mengendapkan ramnosa dan glukosa. Lapisan eter, setelah dikeringkan dengan menggunakan natrium sulfat akan didapatkan aglikon flavonoid setelah diuapkan (Mabry et al, 1970). Dengan cara ini berbagai jenis glikosida dapat saling dibedakan dan bila terjadi pemutusan gula, aglikon, gugus basil dan lain-lain dapat dipisahkan dan diidentifikasi.
2.6.4 Kromatografi
Saat ini kromatografi adalah teknik pemisahan yang paling umum dan sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dimanfaatkan untuk analisis baik secara kualitatif dan kuantitatif atau bahkan analisis preparatif. Teknik kromatografi telah berkembang dan digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi komponen- komponen yang kompleks, baik organik maupun anorganik (Sudjadi, 2007).
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan yang pertama kali dipakai untuk memisahkan zat-zat warna tanaman.Pemisahan dengan teknik ini dijalankan dengan mengadakan manipulasi atas dasar perbedaan sifat-sifat fisik dari zat-zat yang menyusun suatu campuran (Adnan, 1997).
Semua teknik kromatografi pada dasarnya menggunakan dua fasa, yaitu fasa tetap dan fasa bergerak. Pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari kedua fasa tersebut. Kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat dari fasa tetap, jika berupa zat padat dikenal sebagai kromatografi serapan (absorption chromatography) dan jika berupa zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi (partition chromatography) (Sastrohamidjojo, 1985).
Proses Sorpsi
Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fasa gerak ke fasa diam, sedangkan proses sebaliknya pemindahan solut dari fasa diam ke fasa gerak disebut desorpsi. Keduanya terjadi secara terus-menerus selama pemisahan karena sistem kromatografi berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fasa yang sesuai dengan perbandingan distribusinya untuk menjaga keadaan yang setimbang. Beberapa mekanisme yang terlibat pada proses sorpsi yaitu adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi ukuran.
Adsorben
Silika gel merupakan jenis adsorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas. Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar sehingga dapat membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar.
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaannya karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu 1050C, meskipun demikian reprodusibilitasnya sulit dicapai kecuali jika suhu dan kelembapan benar-benar dijaga secara hati-hati. Semakin polar solut maka akan semakin tertahan kuat ke dalam adsorben silika gel ini (Sudjadi, 2007).
2.6.4.1 Kromatografi Lapis Tipis
Dalam kromatografi lapis tipis, fase diamnya merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30µm. Semakin kecil ukuran partikel fase diam, maka semakin baik kinerja efisiensi dan resolusi kromatografi lapis tipis. Penjerap yang sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembangakan bergerak sepanjang fase diam akibat adanya pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) ataupun pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Sudjadi, 2007).
2.6.4.2Kromatografi Kolom
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca. Pelarut sebagai fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom. Pita senyawa pelarut bergerakmelalui kolom dengan laju berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom (Gritter, 1991).
Untuk menghasilkan data yang ada manfaatnya, kecepatan elusi harus dibuat konstan.Kecepatan elusi tergantung dari ukuran partikel bahan isian, dimensi dari kolomnya, viskositas cairannya dan tekanan yang dipakai untuk mengalirkan zat pelarut (Adnan, 1997).
2.6.5 Kristalisasi
Kristalisai adalah pengendapan kristal dari larutan yang terbuat dari bhan tertentu. Selama proses pembentukan kristal, molekul akan cenderung menjadi melekat kristal tumbuh terdiri dari jenis yang sama molekul karena cocok dalam kisi kristal untuk molekul struktur yang sama daripada molekul yang lain. Jika proses kristalisasi diperbolehkan untuk terjadi dalam mendekati kondisi kesetimbangan, preferensi molekul untuk deposit pada permukaan terdiri dari molekul seperti akan menyebabkan peningkatan dalam kemurnian bahan kristal. Sehingga proses rekristalisasi adalah salah satu metode yang paling penting tersedia bagi ahli kimia untuk pemurnian padatan (Pasto, 1992).
2.6.5.1 Rekristalisasi
Amorf yang diperoleh dari hasil isolasi dilarutkan kembali dengan EtOAc, diaduk hingga semua amorf larut sempurna.Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan – lahan hingga pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di dasar wadah.Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut (Jacobs, 1974).