Mekanisme kerja enzim RNA Helikase
2.4 Pemurnian Protein Inhibitor
Pemurnian protein adalah serangkaian proses yang dilakukan untuk mengisolasi suatu jenis protein dari suatu campuran yang kompleks. Berbagai langkah dalam proses pemurnian akan melepaskan protein dari matriks yang mengikatnya, dan memisahkan protein dan bagian yang bukan protein dari larutan campuran, dan akhirnya memisahkan protein yang diinginkan dari seluruh protein lainnya. Pemisahan campuran protein dari suatu ekstrak kasar menjadi komponen-komponennya sangat penting, salah suatu caranya adalah dengan kromatografi yang ditemukan oleh Tswett pada tahun 1903.
Teknik ini bermanfaat sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam 2 fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Menurut IUPAC (International Union and Pure Applied Chemistry), kromatografi adalah metode yang digunakan terutama untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara 2 fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan yang dilapiskan pada padatan atau gel. Fasa diam dapat dimasukkan dalam suatu kolom, ditabur sebagai lapisan dan didistribusikan sebagai film.
Beberapa teknik dengan berbagai kombinasi telah digunakan untuk mendapatkan protein inhibitor murni dari S. chartreusis 5-095. Pada umumnya metode purifikasi yang dilakukan melibatkan beberapa tahapan pemurnian seperti pengendapan protein dengan amonium sulfat, kromatografi gel filtrasi, kromatografi lapis tipis dan pemisahan HPLC.
2.4.1 Pengendapan Protein
Pengendapan protein yang dilakukan pada tahap awal fraksinasi merupakan teknik pemisahan berdasarkan kelarutan menggunakan garam amonium sulfat. Pengendapan dilakukan terhadap cairan biakan sel dari biakan fermentasi dan diendapkan dengan berbagai kejenuhan amonium sulfat. Pada umumnya teknik pengendapan menggunakan amonium sulfat dapat mengendapkan protein karena terikatnya molekul air oleh ion garam. Molekul air akan berkurang dan bagian hidrofobik protein akan saling bergabung membentuk agregat. Metode ini menguntungkan karena mudah dan efektif dilakukan, akan tetapi memiliki kekurangan yaitu memungkinkan ikut terendapnya protein dan molekul lain seperti glikogen, pati, atau polisakarida.
Ada beberapa metode pengendapan protein, dan yang umum digunakan adalah pengendapan dengan induksi garam. Pada kondisi larutan garam yang rendah, kelarutan protein cenderung meningkat yang disebut dengan istilah salting in. Namun pada saat konsentrasi garam terlarut tinggi, kelarutan protein akan turun dengan cepat sehingga protein mengendap. Fenomena ini disebut salting out. Metode lain adalah dengan menambahkan bahan organik terlarut. Jika medium menurun konstanta dielektriknya dengan penambahan bahan organik, maka kelarutan protein menurun sehingga akan diperoleh endapan. Metode ketiga adalah dengan mengubah pH larutan protein yang menyebabkan perbedaan gugus fungsional pada protein.
Proses pengendapan menggunakan amonium sulfat dapat dikelompokkan menjadi dua bagian yaitu salting in dan salting out. Pada salting in, garam yang ditambahkan tidak jenuh atau pada konsentrasi rendah sehingga protein menjadi bermuatan dan larut dalam larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan peningkatan konsentrasi garam. Bila konsentrasi garam ditingkatkan terus, maka justru kelarutan protein akan turun. Bahkan pada konsentrasi garam yang lebih tinggi, protein akan mengendap. Proses penambahan garam amonium sulfat jenuh pada isolasi protein dinamakan salting out (Widyarti 2006).
Mekanisme dalam salting out sangat kompleks, tapi diperkirakan bahwa pengendapan terjadi karena proses persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air. Pada konsentrasi tinggi, kekuatan ionik garam semakin kuat sehingga
garam dapat lebih mengikat molekul air. Dengan demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada protein sehingga gaya tarik menarik antara molekul protein lebih kuat bila dibandingkan dengan gaya tarik menarik antara molekul protein dengan air, sehingga protein akan mengendap (Widyarti 2006). Wang (2006) menyatakan, kelarutan protein tergantung pada konsentrasi garam dalam larutan. Pada konsentrasi garam yang rendah, keberadaan garam akan menstabilkan berbagai golongan muatan molekul protein sehingga protein menjadi lebih tertarik pada larutan dan meningkat kelarutannya. Keadaan ini dikenal dengan istilah salting in. Bagaimanapun, saat konsentrasi garam terlarut semakin meningkat, kelarutan protein akan mencapai batas optimum. Peningkatan konsentrasi garam lebih lanjut akan menyebabkan lebih sedikit kandungan air dalam larutan untuk melarutkan protein. Akhirnya, protein akan mengendap jika tidak ada lagi cukup air untuk berikatan. Fenomena pengendapan protein dalam larutan dengan kadar garam jenuh disebut salting out.
Selama proses salting out, sangat penting untuk tetap menjaga konsentrasi garam agar tidak menurun dalam larutan sehingga tidak terjadi pengendapan yang bersamaan antara protein yang ingin dimurnikan dengan protein yang tidak diinginkan. Dengan demikan selalu dilakukan pengadukan selama penambahan garam dalam prosedur salting out (Widyarti 2006).
2.4.2 Kromatografi Gel Filtrasi
Kromatografi gel filtrasi adalah suatu metoda untuk pemisahan protein dan peptida berdasarkan pada ukurannya. Matriks kromatografinya terdiri atas gel berpori. Ukuran dari gel berpori tersebut menunjukkan ukuran dari makromolekul yang dapat terfraksinasi, sehingga protein atau peptida yang terlalu besar untuk masuk ke dalam pori akan tersingkirkan dan selanjutnya terelusi dari kolom terlebih dulu. Makromolekul yang masuk ke dalam pori-pori, akan tinggal sedikit lebih lama di dalam matriks dan akan dikeluarkan dari kolom kemudian. Akhirnya molekul kecil yang masuk ke hampir seluruh pori matriks, akan terelusi belakangan dengan volume larutan eluen yang lebih banyak. Metoda ini dikenal pula dengan nama gel permeasi, penyaringan molekul, gel eksklusi dan kromatografi eksklusi berdasarkan ukuran (size-exclusion chromatography). Kromatografi gel filtrasi jarang
menginaktifasi enzim, sehingga sering kali digunakan sebagai langkah yang penting dalam purifikasi peptida atau protein.
Beberapa matriks yang digunakan dalam gel filtrasi adalah dekstran, akrilamid, agarosa dan polistiren, sehingga beberapa istilah juga digunakan untuk matriks gel filtrasi sesuai dengan bahan polimer yang membuatnya. Contohnya adalah Sephadex (gel dekstran), Sepharose (gel agarosa), Sephacryl (dekstran/ bis akrilamid) dan sebagainya (Hedlund 2004).
Gel dekstran yang biasa disebut juga dengan istilah Sephadex memiliki sifat tahan terhadap garam atau basa pada konsentrasi tinggi, akan tetapi rusak oleh asam (di bawah pH 2) dan oksidator kuat. Contoh-contoh Sephadex yang biasa digunakan untuk filtrasi gel adalah Sephadex G-25, Sephadex G-50 dan sebagainya. Salah satu bahan yang penting sebagai gel adalah dekstran (polimer gula yang biasanya larut dalam air) yang telah mengalami reaksi "cross linkage" dengan bantuan epikhlorhidrin. Hasil yang di dapat adalah dekstran yang menjadi tidak larut di dalam air, akan tetapi masih dapat menyerap molekul-molekul air di dalam molekulnya sendiri. Daya serap ini bergantung kepada jumlah “cross linkage" atau ikatan silang yang terjadi. Makin banyak ikatan silang daya serapnya makin kurang baik. Gel filtrasi merupakan teknik pemurnian yang efektif di dalam pemisahan enzim dari pelarut penggumpal, larutan garam dan bufer yang tidak dikehendaki. Kapasitas sampel cukup tinggi dan efisiensi gel filtrasi meningkat dengan semakin tingginya kolom (Ersson et al. 1998; Janson & Ryden 1998; Harris 1989).
Pada filtrasi gel tidak terjadi ikatan antara matriks dengan protein yang akan dipisahkan, sehingga komposisi bufer tidak mempengaruhi resolusi secara langsung. Pemisahan dari molekul tergantung pada spesifikasi medium gel filtrasi yang digunakan dan volume hidrodinamik dari molekul protein itu sendiri. Volume hidrodinamik bergantung pada ukuran dan bobot molekul protein tersebut. Beberapa keuntungan proses kromatografi adalah pelaksanaan yang sederhana, penggunaan waktu yang relatif singkat dan memiliki resolusi kepekaan yang tinggi. Teknik ini merupakan teknik pemisahan makromolekul protein berdasarkan ukuran relatif dari molekul protein (Harris, 1989). Filtrasi gel sangat sesuai untuk memisahkan biomolekul yang sensitif terhadap perubahan pH, konsentrasi ion logam atau ko faktor dan kondisi lingkungan yang ekstrim (Widhyastuti 2007).
2.4.3 Pemekatan Enzim dengan Pengeringbekuan
Seringkali sebelum proses pemurnian perlu pula dilakukan pemekatan larutan enzim. Hal ini terutama penting untuk pemurnian protein dari bakteri atau biakan jaringan (Harris 1989). Pemekatan protein dilakukan dengan cara pengeringbekuan, dan ekstraksi. Pengeringbekuan adalah suatu proses dimana air dihilangkan dari fasa beku melalui proses sublimasi. Pengeringbekuan banyak digunakan dalam penyimpanan berbagai material organik, diantaranya yaitu sel bakteri, dan senyawa biologis lain seperti enzim. Salah satu keuntungan proses pengeringbekuan adalah dapat diminimalisirnya perubahan kimiawi dari material organik tersebut, melalui pemekatan larutan, selain itu penggunaan suhu yang rendah akan mengurangi laju reaksi kimia (Rudge 1984).
Dalam penelitian ini pemekatan protein inhibitor dilakukan dengan cara mengeringbekukan sampel protein inhibitor yang telah dibekukan ke dalam suatu alat yaitu freeze dryer Dynafac, dan dikeringbekukan selama semalam.
2.4.4 Kromatografi Lapis Tipis (TLC)
TLC plate adalah suatu lempengan dari gelas, metal atau plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis dari adsorben yang padat, biasanya berupa silika atau alumina . Sejumlah kecil campuran yang akan dianalisis ditotolkan di dekat dasar lempeng TLC tersebut. Lempeng TLC selanjutnya ditempatkan di dalam bejana pengembang yang berisi larutan solven pengembang, jadi hanya di bagian dasar dari lempeng tersebut yang terendam dalam larutan pengembang. Larutan pengembang tersebut adalah fasa geraknya, perlahan-lahan akan bergerak naik pada lempeng TLC melalui aktivitas kapiler.
Pada saat solven bergerak melalui spot yang ditotolkan, suatu keseimbangan akan terbentuk bagi setiap komponen didalam campuran antara molekul dari komponen yang terserap di dalam padatan dan molekul yang ada dalam larutan. Pada dasarnya, masing-masing komponen akan berbeda kelarutan dan kekuatan penyerapannya pada adsorben, dan beberapa komponen akan terbawa ke atas lempeng terlebih dulu dibandingkan dengan yang lain. Ketika solven telah mencapai puncak dari lempeng, lempeng tersebut dikeluarkan dari bejana pengembang,
dikeringkan, dan komponen-komponen yang terpisahkan dari campuran divisualisasikan. Jika senyawa tersebut berwarna, visualisasi dapat dilihat secara langsung. Biasanya untuk senyawa yang tidak berwarna, digunakan lampu UV untuk visualisasinya.
Kekuatan senyawa organik yang mengikat adsorben tergantung pada kekuatan beberapa tipe interaksi berikut ini: ion-dipol, dipol-dipol, ikatan hidrogen dan ikatan van der Walls. Dengan silika gel, kekuatan interaktif dominan antara adsorben dan material yang akan dipisahkan adalah tipe dipol-dipol. Molekul yang sangat polar akan berikatan sedikit kuat dengan ikatan Si-O yang polar dari adsorben tersebut dan kemudian akan menyerap ke dalam partikel-partikel kecil dari adsorben, dimana molekul dengan polaritas yang lemah akan terikat kurang kuat. Molekul dengan polar yang lemah selanjutnya akan terus bergerak disepanjang adsorben lebih cepat dibandingkan dengan molekul polar
(http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/TLC/TLC.html).
Silika gel adalah suatu bentuk silikon dioksida (silika). Atom silikon bergabung dengan atom-atom oksigen dalam struktur kovalen raksasa. Akan tetapi, dipermukaan silika gel, atom-atom silikon terikat menjadi gugus -OH. Jadi di permukaan silika gel akan terdapat ikatan Si-O-H selain dari ikatan Si-O-Si. Permukaan dari silika gel sangat polar, karena dengan adanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa disekitarnya.
(http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html)
2.4.5 Fraksinasi HPLC
High-performance liquid chromatography (HPLC), adalah suatu teknik yang mapan, kokoh, dan banyak digunakan untuk mengisolasi senyawa aktif dari produk-produk alami. Perbedaan utama antara HPLC dengan mode lainnya dalam kolom kromatografi adalah diameter dari partikel-partikel fasa stasionernya yang komparatif (3-10 µm), dan partikel-partikel ini di dikemas padat untuk memberikan struktur kolom yang sangat seragam. Diameter partikel yang kecil berarti bahwa tekanan tinggi diperlukan untuk mengalirkan solven eluen di sepanjang kolom, tetapi energi yang digunakan untuk HPLC sangat tinggi, karena total area permukaan yang memungkinkan untuk berinteraksi dengan solut juga sangat tinggi (sekitar 100-300 m2/g untuk fasa stasioner dengan diameter 5-µm) dan keseragaman dari struktur
kolom. HPLC menunjukkan efisiensi pemisahan yang tinggi yang dapat diperoleh dengan cepat, dan ekonomis dalam skala yang cukup jumlahnya untuk pemeriksaan secara spektroskopis, uji biokimia dan pengujian biologis (DOI: 10.1007/978-1-59259-256-2_6)