Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan Oktober 2016 di Stasiun Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (SKIPM) Kelas I Medan I, Kuala Namu Medan. Prosedur Penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.
Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah inkubator, laminar air flow, autoclave, erlenmeyer, vortex stirrer, aluminium foil, lampu bunsen, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung, jarum ose, pipet tetes, mikroskop, cover glass, paper disk, timbangan digital, mortar porselen, gelas beaker, pisau, kamera digital, sarung tangan, masker, kertas label, dan alat tulis. Alat penelitian dapat dilihat pada Lampiran 2.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan Mas (Cyrpnus carpio), isolat bakteri patogen Aeromonas hydrophila, media Tryptone Soya Agar (TSA), media Triple Sugar Iron Agar (TSIA), media Sulfid Indol Motility (SIM), media Strach Agar, media Skim Milk Agar (SMA), media Methly Red, media Voges Proskaurt (VP), media Simmons Citrate, media gula-gulaan (glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa), reagen Kovac, methyl red, kristal violet, iodine, safranin, alkohol 95%, akuades, hidrogen peroksida (H2O2) 3%, alkohol, larutan fisiologis (NaCl 0,9 %) dan larutan Mc Farland. Bahan penelitian dapat dilihat pada Lampiran 2.
Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel
Ikan dibedah secara aseptis untuk diambil organ pencernaannya (lambung dan usus), kemudian dimasukkan kedalam larutan fisiologis (NaCl 0.9%) pada pH 2 dengan tujuan hanya bakteri probiotik yang dapat tumbuh dan berkembang pada pH tersebut. Selanjutnya, lambung dan usus dihancurkan atau dihaluskan dengan menggunakan mortar porselen. Sampel yang telah dihaluskan, kemudian dilakukan pengenceran berseri 10-1 sampai 10-5
Metode seri pengenceran yang dilakukan yaitu dengan mengambil sebanyak 1 ml sampel, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril lalu dihomogenisasi menggunakan vortex stirrer selama 2-4 menit sehingga didapat pengenceran 10
.
-1, untuk mendapatkan pengenceran 10-2 dilakukan dengan mengambil 1 ml dari pengenceran 10-1 dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril, demikian seterusnya dilakukan seri pengenceran hingga 10-5. Pengenceran 10-4 dan 10-5
Setelah inkubasi selama 24 jam, koloni dengan penampakan morfologi yang berbeda dari warna, bentuk, tepian, dan elevasi pada medium TSA kemudian diambil dan dimurnikan (diisolasi) pada media baru TSA dengan menggunakan metode cawan gores dengan beberapa tahap sampai didapatkan koloni bakteri tunggal sebagai isolat murni, kultur diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam.
masing-masing diambil 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium TSA dengan menggunakan metode cawan sebar (spread plate), kemudian diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam. Proses isolasi bakteri dapat dilihat pada Lampiran 3.
kemampuan mendegradasi protein dan karbohidrat dengan melakukan serangkaian uji hidrolisis pati (amilum) dan uji hidrolisis kasein (protein) serta melakukan uji penghambatan bakteri potensial probiotik terhadap bakteri patogen untuk mengetahui bakteri potensial probiotik yang berhasil didapatkan mampu menghambat bakteri patogen yang sering menyerang ikan budidaya.
Uji Hidrolisis Pati (Amilum)
Suspensi bakteri hasil biakan murni diambil satu ose dan digoreskan pada cawan yang berisi media Strach Agar, dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan uji iodine dengan cara meneteskan iodine pada permukaan agar yang berisi isolat. Uji hidrolisis pati positif ditandai dengan adanya zona kuning bening di sekeliling isolat yang mengindikasikan enzim amilase diproduksi oleh isolat sehingga di daerah tersebut amilum sudah dihidrolisis (Cappucino, 1983).
Uji Hidrolisis Kasein (Protein)
Suspensi bakteri hasil biakan murni diambil satu ose dan digoreskan pada cawan yang berisi media Skim Milk Agar (SMA), dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Uji hidrolisis protein positif ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling koloni yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut mempunyai aktivitas proteolitik (Fardiaz, 1992).
Uji Penghambatan Bakteri Uji Patogen
Metode yang digunakan adalah metode cawan sebar (spread plate).
Bakteri uji patogen dan bakteri potensial probiotik disuspensikan hingga kekeruhannya sama dengan larutan suspensi Mc Farland yaitu 108 CFU/ml.
Bakteri uji patogen diisolasi kedalam cawan petri yang berisi media TSA dengan
teknik cawan sebar (spread plate), kemudian paper disk yang telah direndam kedalam kultur cair isolat bakteri potensial probiotik ditanam dengan cara ditekan ke atas media TSA. Selanjutnya inkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam. Setelah inkubasi diamati adanya indikasi penghambatan dengan terbentuknya zona bening pada media yang berarti menunjukkan kemampuan menghambat bakteri uji patogen (Aryati dan Hambali, 2004). Uji penghambatan bakteri uji patogen dapat dilihat pada Lampiran 4.
Identifikasi Spesies Bakteri Potensial Probiotik Karakterisasi Morfologi Isolat
Isolat bakteri murni diidentifikasi morfologi selnya dengan menggunakan uji pewarnaan gram dan pengamatan bentuk bakteri secara mikroskopik.
Pewarnaan gram dilakukan dengan membersihkan kaca objek dengan alkohol dan disterilkan pada nyala api bunsen, kemudian diambil isolat bakteri dengan jarum ose dan dioleskan pada object glass. Isolat bakteri kemudian ditetesi kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dianginkan hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi kembali dengan larutan iodine dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dianginkan hingga kering. Selanjutnya isolat bakteri ditetesi alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dialiri air dan dianginkan hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi safranin selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan, kemudian dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop.
Bakteri gram positif ditandai dengan warna ungu yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu mengikat warna kristal violet, sedangkan bakteri gram negatif ditandai dengan warna merah muda yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak mampu mengikat warna kristal violet dan hanya terwarnai oleh safranin (pewarna tandingan) (Hadioetomo, 1993). Bakteri yang tumbuh kemudian diamati bentuk selnya secara mikroskopik pada kaca preparat sehingga dapat diketahui bentuknya (kokus, batang atau spiral).
Identifikasi Berdasarkan Uji Biokimia Uji Katalase
Sebanyak 2 tetes H2O2
Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang menunjukkan bahwa organisme yang bersangkutan menghasilkan enzim katalase yang mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dan uji negatif ditandai dengan tidak adanya perubahan atau gelembung-gelembung oksigen pada isolat bakteri (Hadioetomo, 1993).
3% diletakkan pada object glass steril. Isolat bakteri diambil menggunakan jarum ose steril, kemudian dipindahkan ke atas kaca objek dan dicampurkan.
Uji Motilitas
Sebanyak satu ose isolat bakteri ditusukkan ke medium uji SIM dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC.
Uji positif ditandai dengan pertumbuhan bakteri yang menyebar, maka bakteri tersebut bergerak (motil) dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar
hanya berupa satu garis, maka bakteri tersebut tidak bergerak (non motil) (Sudarsono, 2008).
Uji Indol
Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasi kedalam medium uji SIM dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC. Setelah inkubasi ditambahkan 10-12 tetes reagen Kovac.
Uji positif ditandai dengan terbentuknya lapisan berwarna merah di bagian atas biakan dan uji negatif jka lapisan berwarna kuning (Hadioetomo, 1993).
Uji MR
Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasi kedalam media MR-VP dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC. Setelah inkubasi selama 24 jam, media ditambahkan 3-4 tetes indikator metil red.
Uji positif ditandai dengan perubahan warna medium menjadi merah, artinya terbentuk asam dan uji negatif ditandai dengan tidak adanya perubahan warna pada media (Hadioetomo, 1993).
Uji Simmons Citrate
Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasi secara zig-zag pada permukaan agar miring media Simmons Citrate dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC.
Uji positif ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi biru dan uji negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna pada media (Sudarsono, 2008).
Uji TSIA
Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasi kedalam media TSIA dengan cara menusuk tegak lurus pada bagian butt (tusuk) dan cara zig zag pada bagian slant (miring) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC.
Perubahan warna kemudian diamati, apabila bagian slant berwarna merah dan butt berwarna kuning maka bakteri mampu memfermentasi glukosa, sedangkan apabila bagian slant dan butt keduanya berwarna kuning maka bakteri mampu memfermentasi sukrosa dan laktosa (Yusuf, 2009).
Uji Gula-gulaan
Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasikan ke dalam tabung-tabung reaksi yang berisi medium fermentasi glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa, dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC.
Uji positif ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning dan apabila dalam tabung terdapat gelembung, berarti fermentasi tersebut menghasilkan gas (CO2
Analisis Data
).
Data yang telah diperoleh dianalisis secara deskriptif dengan mendeskripsikan secara sistematis dan akurat secara ilmiah. Hasil uji terhadap isolat-isolat yang diperoleh, dilakukan upaya identifikasi bakteri berdasarkan karakter biokimia sesuai dengan tabel biokimia dengan berpedoman pada buku
“Cowan amd Steels’s Manual for The Identification of Medical Bacteria” dan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 8th Edition.