Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2005 hingga bulan Maret 2008 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman dan Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia – The Netherlands), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah daun dan akar M. malabathricum
L. yang diperoleh dari lahan asam Jasinga, Bogor. Plasmid pGEM®-T-Easy (Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan dan E. coli galur DH5α digunakan sebagai inang vektor rekombinan. Primer aktin
ActF:TCACCAACTGGGACGACATG dan ActR: TCATGAGGTAGTCAGTCAGGT
digunakan sebagai alat evaluasi cDNA total. Primer spesifik dari gen SNR A.
thaliana L. yaitu snrF: ATGGATATTGATCACGGCAGA dan snrR:
ATAACCACGTCAGG CAAAGG digunakan untuk mengisolasi cDNA MmFSNR.
Metode penelitian
Isolasi dan pengklonan fragmen MmFSNR dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu isolasi RNA total, sintesis cDNA total, isolasi cDNA MmFSNR, pengklonan cDNA MmFSNR ke dalam vektor, transformasi genetik E. coli dan analisis MmFSNR.
Isolasi RNA total. RNA total diisolasi menggunakan metode Chang et al.
(1993) yang dimodifikasi. Daun dibuang tulangnya, ditimbang sebanyak 1 gram lalu ditambah 10 ml buffer 2XCTAB (2% CTAB, 2% PVP 25000, 0.1 M tris pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% ß-mercaptoetanol dan 0.1% DEPC) yang sebelumnya telah dihangatkan pada suhu 65ºC, digerus dengan bantuan pasir kuarsa hingga menjadi serbuk halus. Campuran serbuk daun dan buffer ekstraksi diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65ºC dan digoyang beberapa kali, diekstraksi dengan 10 ml Kloroform:Isoamilalkohol (24:1) lalu disentrifugasi pada 10000 rpm pada suhu 4oC (Sorval Ultra Pro 80) selama 10 menit. Bagian atas
14
cairan (supernatan) dipindahkan ke tabung baru kemudian ditambah ¼ volume LiCl 10M. Campuran diinkubasi pada suhu -20ºC selama 2.5 jam kemudian disentrifugasi (Sorvall Ultra Pro 80) pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC. Fase cairan dibuang, RNA total yang mengendap disuspensi dengan 500μl TE 1x (10mM Tris HCl pH 7.4 dan 1 mM EDTA) dan dipindah ke tabung eppendorf. RNA diekstraksi dengan 1xvolume fenol pH 9, disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 20 ºC. Suspensi RNA (di bagian atas) dan dipresipitasi dengan penambahan 1 x volume PCI (25:24:1) dan disentrifugasi pada kecepatan 14000rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 20ºC. Supernatan diambil dan dipresipitasi dengan penambahan ¼ x volume LiCl 10M dan kemudian diinkubasi selama semalam pada suhu -20ºC. Untuk mengendapkan RNA total, campuran disentrifugasi pada kecepatan 14000rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 4ºC. Cairan dibuang dan endapan RNA dibilas dengan penambahan 500μl ethanol 70% kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 4ºC. Endapan dikeringkan dengan vacuum dryer selama 15 menit kemudian diresuspensi dengan H2O yang telah diperlakukan dengan DEPC. Kuantitas RNA total hasil isolasi ditentukan dengan spektrofotometer UV-VIS (Cecil CE 2020) pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi RNA ditentukan dengan menetapkan satu satuan absorban pada panjang gelombang 260 nm setara dengan 40 μg/ml RNA. Kemurnian RNA total ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm (Saunders & Parker 1999). Keutuhan RNA ditentukan berdasarkan elektroforesis pada gel agarose 1% (FMC, USA) dengan larutan MOPS (4.2g/l MOPs, 0.41 g/l Na-asetat, 0.37 g/l EDTA (2Na)H2O). RNA sebanyak 1μl dicampur dengan 12 μl larutan premiks [MOPS, 50% (v/v) formamide,17.5% (v/v) formaldehid dan 27.5% (v/v) air DEPC] dipanaskan 65 ºC 10 menit, didinginkan di es 5 menit dan ditambahkan 1/6 x volume loading dye (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 30% gliserol) kemudian dielektroforesis pada 100 volt selama 30 menit. Visualisasi RNA dilakukan pada transiluminator GelDoc (Labquip) setelah diwarnai dengan EtBr selama 30 menit dan dibilas dengan H2O.
15
Sintesis cDNA total. cDNA total disintesis melalui reaksi transkripsi balik
(ReverseTranscriptase/RT) menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Komposisi sintesis cDNA total adalah 5 μg RNA total, 1x RT buffer, 20 pmol oligodT, 4mM dNTP, 10mM DTT, 40 U Enzim SuperScript TM
III RTase
dan dH2O yang telah diperlakukan dengan DEPC hingga volume reaksi mencapai 20μl. Sintesis cDNA dilakukan pada suhu 52°C selama 50 menit. Keberhasilan terbentuknya cDNA dan kemurnian cDNA diuji dengan menggunakan PCR dengan primer spesifik aktin. Komposisi reaksi PCR adalah 0.75 μl cDNA total hasil RT, 1x Buffer taq, 30 mM MgCl2, 3 mM dNTP mix, 15 pmol primer ActF, 15 pmol primer ActR, 4% Me2SO, 0.75 U enzim taq DNA polymerase (Fermentas Inc.) dan ddH2O dengan volume reaksi 15 μl. PCR dilakukan pada kondisi praPCR pada 95 °C 5 menit, denaturasi pada 94°C 30 detik, penempelan primer pada 57°C selama 30 detik dan pemanjangan pada 72° C selama1.5 menit. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dan pascaPCR dilakukan pada suhu 72°C selama 5 menit. Hasil PCR actin dielektroforesis dalam gel agarose 1.2% dengan larutan penyangga TAE 1X (4.84 g/l Tris Hydroximetilaminomethan, 0.1142 ml/l asetat glasial, 2 ml 0.5M EDTA pH 8). Elektroforesis dilakukan pada voltase konstan 50 volt selama 1 jam. Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan diatas transiluminator UV (Hoever) dan difoto menggunakan kamera digital yang dihubungkan ke komputer dengan menggunakan program Digidoc. Bila hasil visualisasi menunjukkan pita ukuran 450bp maka RNA yang digunakan sebagai bahan reaksi RT murni dan cDNA total tidak terkontaminasi DNA genom sehingga cDNA total ini dapat digunakan untuk mengisolasi cDNA MmFSNR.
Isolasi cDNA MmFSNR. Reaksi PCR dengan primer spesifik dilakukan
menggunakan cDNA hasil RT dan sepasang primer spesifik untuk snrF dan snrR yang didisain dari A. thaliana. Campuran PCR terdiri dari 2 μl 10X PCR Buffer (200mM Tris HCl pH 8.4, 500mM KCl) (Fermentas), 2 μl 25mM MgCl2
(Fermentas), 1 μl 10mM dNTP Mix, 1 μl primer forward (10 pmol), 1 μl primer
reverse (10 pmol), 0.2 μl Taq DNA polymerase (5 Unit/μl),1 μl cDNA (hasil RT)
dan ddH2O hingga volume mencapai 20 μl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR pada 94°C, 5 menit; denaturasi pada 94°C, 30 detik; penempelan primer pada 55°C , 30 detik; dan pemanjangan pada 72°C, 7 menit sebanyak 35 siklus
16
menggunakan alat PCR (MJ Research TM 100). Hasil PCR dengan primer spesifik kemudian diuji dengan elektroforesis.
Pengklonan cDNA MmFSNR kedalam vektor pGEM®-T-Easy. Hasil
sintesis cDNA spesifik dari mRNA Melastoma selanjutnya disisipkan ke dalam vektor pGEM®-T-Easy (Promega) mengikuti prosedur Promega. Ligasi dilakukan dengan mencampurkan 1- 3 μl cDNA spesifik dengan 5 μl buffer 2X Rapid
Ligation,1μl vektor pGEM®-T-Easy (50ng), 1 μl T4 DNA Ligase (3 Weiss units/μl), dan ddH2O sampai volume akhir 10 μl. Campuran reaksi diinkubasi pada 4 OC selama semalam.
Transformasi genetik E. coli. Transformasi E. coli dengan vektor
rekombinan dilakukan berdasarkan prosedur Suharsono (2002). Satu koloni bakteri E. coli galur DH5α dikulturkan dalam 2 ml LB cair (10g/l Bacto-tryptone, 5 g/l Yeast extract, 10 g/l NaCl) menggunakan shaking incubator berkecepatan 250 rpm pada suhu 37ºC selama semalam. Kemudian, 200 μl disubkultur dalam 20 ml LB cair dengan kondisi yang sama hingga OD600=0.4-0.5. Bakteri dipindahkan ke tabung eppendorf 1.5 ml dan diinkubasi dalam es selama 10 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 3000rpm (Jouan BR4i) pada suhu 4ºC selama 5 menit. Endapan bakteri disuspensi dalam 495 μl buffer transformasi TB (10mM PIPES, 15mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2.4H2O, pH 6.7) dan diinkubasi dalam es selama 10 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000rpm pada suhu 4ºC selama 5 menit. Endapan bakteri ditambah 82.5 μl TB dan disuspensi dengan hati-hati kemudian ditambah 3.3 μl DMSO dan diinkubasi di dalam es selama 10 menit sehingga diperoleh bakteri kompeten. Sebanyak 50µl dari bakteri kompeten tersebut dicampur dengan 10µl (50-100ng) DNA plasmid hasil ligasi dan diinkubasi dalam es selama 25 menit. Campuran dipanaskan pada suhu 45ºC selama 45 detik dan diinkubasi kembali ke dalam es selama 5 menit. Campuran ini ditambah 100µl media 2xYT (16g/l Bacto-tryptone, 10g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl pH 7.0) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 20 menit dalam shaking incubator berkecepatan 250 rpm. Bakteri disebar merata diatas media LB yang mengandung ampicilin menggunakan batang kaca yang dibengkokkan lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama semalam. Seleksi transforman rekombinan dilakukan dengan memilih koloni putih yang tumbuh.
17
Analisis cDNA sisipan. Analisis cDNA sisipan dimulai dengan isolasi
plasmid rekombinan. Plasmid diisolasi menggunakan prosedur Suharsono (2002). Kultur E. coli sebanyak 150 µl ditumbuhkan dalam 15 ml media LB dan diinkubasi di inkubator bergoyang (250 rpm) pada suhu 37OC semalam. Kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm (Jouan BR4i) pada suhu 4OC selama 30 menit. Pelet disuspensikan dengan 300μl buffer suspensi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5 dan 10 mM EDTA). Suspensi bakteri ditambah 300μl buffer lisis (0,2 M NaOH dan 1% SDS) dan dibolak balik perlahan beberapa kali. Campuran ditambah 300μl buffer netralisasi (5 M Na-Asetat, Asam asetat glasial, dan H2O PH 4,8) dan disentrifugasi 13000 rpm pada suhu 4OC selama 20 menit. Supernatan diambil dan diekstrak dengan 1xvolume PCI (25:24:1), divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu 4OC selama 2 menit. Supernatan diambil dan diperlakukan dengan RNAse pada suhu 37OC semalam. Larutan diekstrak kembali dengan PCI dan disentrifugasi seperti ekstraksi sebelumnya. Supernatan diambil dengan hati-hati dan ditambahkan 0,1x volume 3 M NaOAc pH 5.2 dan 2x volume EtOH absolut. Larutan diinkubasi selama 2 jam pada suhu -20 OC dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu 4OC selama 20 menit. Pellet dibilas dengan 1 x volume EtOH 70% dan dikeringkan dengan alat vakum. DNA kering disuspensikan di 10-20 μl ddH2O.
Analisis urutan nukleotida MmFSNR dan protein MmFSNR.
Pengurutan DNA dilakukan menggunakan DNA Sequencer ABI Prism Model 310 versi 3.7. Identifikasi urutan nukleotida dilakukan menggunakan beberapa analisis. Analisis kesejajaran lokal fragmen MmFSNR berdasarkan urutan nukleotida dan asam amino dengan data yang ada di GenBank dilakukan dengan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) yang tersedia dalam NCBI (National Center for Biotechnology Information) melalui akses situs http://www.ebi.ac.uk/BLAST (Mount, 2001). Analisis situs restriksi dilakukan dengan menggunakan program Bioedit versi 7.0.0 dan NEBCutter
(http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.htm). Program Bioedit versi 7.0.0 juga
digunakan untuk melakukan analisis deduksi asam amino dari urutan DNA dan analisis hidrofobisitas protein MmFSNR yang dibandingkan dengan protein SNR pada padi dan pada Medicago truncantula.