BAB III METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi daun beluntas dan daun kemangi
Determinasi dilakukan dengan menggunakan kunci determinasi dengan mengacu pada Buku Acuan Flora untuk Sekolah di Indonesia.
2. Pengumpulan, pengeringan dan pembuatan serbuk bahan
Dua kilogram daun beluntas kering diperoleh dari Merapi Farma Herbal. Dua puluh lima kilogram kemangi segar diperoleh dari Pasar Beringharjo. Daun kemangi dipisah dengan batang dan bunganya untuk selanjutnya dicuci dengan air bersih dan dikeringkan.
Pengeringan daun kemangi dilakukan di dalam oven pada suhu 40-50oC selama ± 24 jam. Kedua daun yang sudah kering kemudian diserbuk dengan cara diblender dan diayak dengan ayakan tepung.
3. Pembuatan ekstrak etanol daun beluntas dan daun kemangi dengan metode maserasi
Tiga puluh gram serbuk kering simplisia daun beluntas ditambah dengan 160 ml etanol 70% kemudian dimaserasi. Tiga puluh gram serbuk simplisia daun kemangi ditambah dengan 180 ml etanol 70% dan dimaserasi. Maserat daun beluntas disaring dengan bantuan vakum dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga pelarutnya menguap sebanyak ± 35 ml (Lampiran 6 gambar A). Maserat daun kemangi juga disaring dan dipekatkan hingga pelarutnya menguap sebanyak ± 40 ml (Lampiran 6 gambar B). Untuk mendapatkan ekstrak kental, setelah dipekatkan maka ekstrak dioven pada suhu 50oC selama ± 24 jam.
4. Pembuatan seri konsentrasi
Dibuat konsentrasi 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50% dari ekstrak kental daun beluntas dan daun kemangi. Pembuatan konsentrasi 50% dengan mengambil ekstrak daun kemangi atau ekstrak daun beluntas
sebanyak 5 gram kemudian dilarutkan dalam 10 ml etanol 70% kemudian diturunkan menjadi konsentrasi 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10% dengan melarutkan ke dalam etanol 70% hingga 10 ml.
5. Uji daya antibakteri ekstrak etanol daun beluntas dan daun kemangi terhadap Staphylococcus epidermidis
a. Pembuatan suspensi bakteri uji
Pembuatan suspensi bakteri uji dilakukan dengan cara menanam kultur bakteri uji di dalam NaCl fisiologis kemudian kekeruhannya diukur menggunakan densicheck sampai 0,5 sesuai dengan larutan standar 0,5 Mac Farland (1,5.108 CFU/ml).
b. Uji daya antibakteri ekstrak etanol daun beluntas dan daun kemangi terhadap Staphylococcus epidermidis dengan metode difusi sumuran
Pengujian daya antibakteri dengan metode difusi sumuran menggunakan 2 macam kontrol, yaitu kontrol media dan kontrol pertumbuhan bakteri uji.
Pembuatan kontrol media yaitu dengan menuang 30 ml MHA pada petri sampai memadat kemudian dibuat sumuran lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji yaitu pertama dibuat base layer menggunakan MHA 5 ml tanpa inokulasi bakteri. Setelah memadat, di atas base layer
ditambahkan seed layer menggunakan MHA 25 ml yang sebelumnya telah ditambahkan dengan 2 ml suspensi bakteri uji dan dibiarkan memadat lagi untuk kemudian dibuat sumuran. Petri diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam.
1) Penanaman isolat Staphylococcus epidermidis secara pour plate
Media yang akan digunakan dibagi menjadi 2 bagian dengan perbandingan volume 1:5. Satu bagian (5 ml) berupa MHA steril tanpa inokulasi bakteri digunakan sebagai base layer, dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat terlebih dahulu. Lima bagian (25 ml) digunakan sebagai seed layer yang dituang ke atas base layer setelah diinokulasi dengan bakteri uji.
Untuk layer atas, diambil 2 ml dari stok suspensi bakteri uji yang sudah disetarakan sesuai dengan larutan standar 0,5 Mac Farland kemudian diinokulasikan ke media MHA secara pour plate. Media MHA yang mengandung bakteri dibiarkan sampai memadat.
2) Inokulasi ekstrak etanol daun beluntas dan daun kemangi dengan metode difusi sumuran
Media agar yang telah diinokulasikan dengan 2 ml suspensi Staphylococcus epidermidis dibuat 5-6 sumuran. Pembuatan sumuran hanya menembus seed layer. Base layer
digunakan sebagai alas agar ekstrak tidak menyebar pada dasar cawan petri. Pada pengujian pertama digunakan konsentrasi ekstrak 10, 15, 20, 15% untuk masing-masing ekstrak, dan pengujian dilanjutkan dengan konsentrasi 30, 35, 40, 45, 50%. Semua konsentrasi ekstrak diinokulasikan pada sumuran yang
telah dibuat. Masing-masing petri juga diinokulasikan dengan kontrol pelarut (etanol 70%). Volume inokulasi sebesar 50 µ l. Kontrol positif yang digunakan adalah Mediklin® (Klindamisin fosfat 1,2%) dengan konsentrasi 2% dan petri diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam dan diukur diameter zona hambatnya menggunakan penggaris.
c. Penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi padat
Pada uji ini menggunakan 3 macam kontrol, yaitu kontrol media, kontrol pertumbuhan bakteri uji dan kontrol pelarut (etanol 70%). Kontrol media dibuat dengan menuang 15 ml media MHA pada petri. Kontrol pertumbuhan bakteri uji dibuat dengan menambahkan 1 ml bakteri uji ke dalam15 ml media MHA kemudian dituang ke petri. Kontrol pelarut dibuat dengan mencampur pelarut ekstrak yaitu 1 ml etanol 70% dan 1 ml bakteri uji dengan 15 ml media MHA kemudian dituang ke petri. Semua petri diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam.
1) Uji daya antibakteri dengan dilusi padat
Uji ini menggunakan 1 ml ekstrak daun beluntas dan ekstrak daun kemangi dengan masing-masing konsentrasi 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 30, 35, 40, 50% ditambahkan dengan 1 ml suspensi bakteri uji yang sudah setara dengan larutan standar 0,5 Mac Farland dan 15 ml media MHA kemudian dituang ke petri. Petri diinkubasi pada suhu 37oC, diamati setelah 18-24 jam.
Kekeruhan media yang menunjukkan kepadatan pertumbuhan bakteri uji diamati, diberi penilaian menggunakan notasi (+) untuk media yang agak keruh, (++) keruh, (+++) sangat keruh dan notasi (-) jika tidak ada kekeruhan yang menandakan tidak ada pertumbuhan dari bakteri uji dalam media tersebut. Kekeruhan masing-masing perlakuan dibandingkan dengan kontrol media dan kontrol pertumbuhan bakteri uji.
2) Penentuan nilai KHM dan KBM
Pengujian selanjutnya dilakukan dengan menentukan nilai KHM dan KBM. Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan dengan melakukan streak plate dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Hasil uji yang digunakan adalah media yang menunjukkan kejernihan secara visual dan selanjutnya di-streak
pada media MHA kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. KHM adalah kadar terkecil yang dapat menghambat bakteri uji, ditandai dengan Staphylococcus epidermidis masih dapat tumbuh pada hasil streak plate, sedangkan KBM adalah kadar terkecil yang dapat membunuh bakteri uji, ditandai dengan
Staphylococcus epidermidis sudah tidak dapat tumbuh pada hasil
streak plate yang menandakan bakteri uji mati karena senyawa uji pada konsentrasi tersebut.
