BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi dilakukan dengan mencocokkan serbuk biji P. americana
yang dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Determinasi dilakukan oleh Yohanes Dwiatamaka, M.Si yang merupakan dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah biji P. americana Mill. yang masih segar dan tidak busuk, diperoleh dari Sumatera Barat pada bulan Januari 2013.
3. Pembuatan serbuk biji P. americana
Biji P. americana dicuci bersih dan dipisahkan dari kulitnya. Setelah itu biji dirajang tipis lalu diangin-anginkan kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50ºC selama 24 jam untuk mengoptimalkan proses pengeringan. Setelah biji benar-benar kering, biji dihaluskan dan diayak dengan ayakan nomor 40. Pengayakan dilakukan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji Persea americana Mill. lebih mudah tersekstrak karena luas permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut semakin besar.
4. Penetapan kadar air pada serbuk kering biji P. americana
Serbuk kering biji P. americana yang sudah diayak, dimasukkan sebanyak ± 5 gram ke dalam alat moisture balance kemudian diratakan. Bobot serbuk kering biji tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum pemanasan (bobot A), setelah itu dipanaskan pada suhu 1100C. Serbuk kering biji P.americana yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan (bobot B). Kemudian dilakukan perhitungan
terhadap selisih bobot A terhadap bobot B yang merupakan kadar air serbuk biji P. americana.
5. Pembuatan ekstrak metanol-air biji P.americana
Ekstrak metanol-air biji P.americana adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering biji P.americana seberat 10,0 g yang dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70% secara maserasi selama 120 jam (5 hari) dengan sesekali diaduk, kemudian diremaserasi selama 48 jam (2 hari). Maserasi dilakukan dalam erlenmeyer bersumbar kaca dan dilakukan pada suhu kamar. Perbandingan jumlah serbuk dan pelarut adalah 1 : 10. Selama proses maserasi, campuran serbuk dan pelarut digojog selama 1 menit setiap harinya dan didiamkan dalam ruangan gelap dan ditutup. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring sehingga diperoleh filtrat dengan bantuan pompa vakum. Filtrat hasil saringan dipindahkan dalam labu alas
bulat untuk dievaporasi dengan mengunakan vacuum rotary evaporator pada
suhu 70 – 900C untuk menguapkan cairan penyari pada proses maserasi. Hasil evaporasi dituangkan dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya agar mempermudah perhitungan rendemen ekstrak yang akan diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan penangas air pada suhu 70 – 800C. Penimbangan terhadap ekstrak dilakukan setiap harinya hingga diperoleh bobot ekstrak tetap. Ekstrak kental disimpan di dalam desikator hingga saat akan digunakan.
Rendemen ekstrak = berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong Rata-rata rendemen =
Konsentrasi ekstrak didapat dari hasil rata-rata bobot ekstrak. Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat. Pada konsentrasi yang digunakan tersebut ekstrak dapat dimasukkan dan dikeluarkan dari spuit oral. Cara pembuatannya adalah dengan melarutkan ekstrak setiap cawan dalam labu ukur 5 ml dengan pelarut yang sesuai (CMC Na 1%). Sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan
6. Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa (CMC-Na) 1%
Larutan CMC-Na 1% dibuat dengan cara menimbang 5 gram CMC-Na
serbuk yang telah digerus dalam mortar dan stamper terlebih dahulu. Serbuk kemudian ditaburkan secara merata di permukaan 200 mL aquadest di dalam gelas kimia dan ditunggu hingga semua serbuk terbasahi, tanpa pengadukan.
Setelah semua serbuk CMC-Na terbasahi maka dilakukan pengadukan hingga
seluruh CMC-Na larut. Larutan CMC-Na kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml dan ditambahkan aquadest hingga batas tanda.
7. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji P.americana dalam CMC-Na 1%
Suspensi ekstrak metanol-air biji P. americana dibuat dengan konsentrasi 7%. Sebanyak 3,5 g ekstrak metanol-air biji P. americana
ditimbang secara seksama. Kemudian dilarutkan dengan menggunakan
labu takar 50 mL dan ditambah dengan larutan CMC-Na 1% hingga batas tanda, selanjutnya digojog hingga homogen.
8. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) konsentrasi 50%
Larutan CCl4 dalam olive oil dibuat dengan cara melarutkan 25 ml CCl4 dalam labu takar 50 ml kemudian ditambahkan dengan olive oil hingga tanda, lalu digojog hingga homogen. Pengambilan CCl4 dilakukan dengan menggunakan pipet gondok 25 ml.
9. Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida
Pemilihan dosis CCl4 dilakukan untuk mengetahui dosis CCl4 yang mampu menyebabkan kerusakan pada hati tikus yang ditandai dengan peningkatan aktivitas ALT dan AST serum. Dosis hepatotoksin yang digunakan dalam penelitian ini didasarkan pada hasil orientasi yang telah dilakukan. Dosis hepatotoksin yang digunakan memberikan peningkatan aktivitas ALT dan AST serum paling tinggi pada hasil orientasi.
Menurut Janakat dan Al-Merie (2002) dosis karbon tetraklorida sebesar 2 ml/kg BB menginduksi kerusakan hati pada tikus jantan galur Wistar. Dosis tersebut mampu merusak sel-sel hati pada tikus jantan yang ditunjukkan melalui peningkatan aktivitas ALT dan AST tetapi tidak menimbulkan kematian pada hewan uji.
b. Penetapan waktu pencuplikan darah
Penetapan waktu pencuplikan darah ditentukan melalui orientasi pada tiga kelompok perlakuan waktu, yaitu pada jam ke-0 sebelum pemejanan karbon tetraklorida, jam ke-24 dan 48 setelah pemejanan karbon tetraklorida. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 hewan uji yang pengambilan darahnya dilakukan melalui pembuluh sinus orbitalis mata.
Pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida yang dilarutkan dalam olive oil dengan perbandingan 1 : 1 pada dosis 2 ml/kgBB mencapai aktivitas ALT serum maksimal pada jam ke-24 setelah pemberian dan mulai menurun pada jam ke-48 (Janakat dan Al-Merie, 2002).
10. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji
Hewan uji tikus jantan galur Wistar sejumlah 30 ekor dibagi secara acak dalam 6 kelompok sama banyak. Kelompok I (kelompok kontrol negatif) diberi olive oil dosis 2ml/kgBB secara intraperitoneal, Kelompok II (kontrol perlakuan) diberikan ekstrak metanol-air biji P.americana dosis 350 mg/kgBB secara peroral kemudian diambil darahnya pada jam ke-6 setelah pemberian ekstrak. Kelompok III (kontrol hepatotosin) diberi karbon tertraklorida yang dilarutkan dalam olive oil (1:1) dengan dosis 2 ml/kgBB secara intraperitoneal. Kelompok IV, V dan VI (kelompok perlakuan) diberi ekstrak metanol-air biji P. americana dosis 350 mg/kgBB, kemudian secara berturut-turut pada jam ke-1, 4 dan 6 setelah pemberian ekstrak metanol-air
dilakukan pemberian hepatotoksin karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB. Pada jam ke-24 setelah pemberian karbon tetraklorida, semua kelompok diambil darahnya pada daerah sinus orbitalis mata untuk penetapan aktivitas ALT dan AST serum.
11. Pembuatan serum
Darah diambil melalui sinus orbitalis mata hewan uji dan ditampung dalam tabung eppendrof dan didiamkan selama 15 menit, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit, lalu dipisahkan dari bagian supernatannya.
12. Pengukuran aktivitas ALT dan AST serum
Micro vitalab 200 adalah alat yang digunakan untuk mengukur aktivitas ALT dan AST serum pada serum hewan uji. Sebelum melakukan pengukuran sampel, alat divalidasi dengan menggunakan serum kontrol kontrol Roche/Hitachi Cobas C series. Kisaran nilai ALT serum kontrol Roche/Hitachi Cobas C series adalah 26,2-41,8 U/L dan AST 35,4-56,6 U/L. Aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 370 C. Aktivitas serum ALT dinyatakan dalam U/L. Pengukuran aktivitas serum ALT dilakukan di laboratorium Biokimia, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Pengukuran aktivitas ALT dan AST serum dilakukan dengan mencampur 100 μl serum dengan 1000 μl reagen I, kemudian divortex selama 5 detik, didiamkan selama 2 menit, setelah itu dicampur dengan 250 μl reagen II, kemudian divortex selama 5 detik dan dibaca serapan setelah 1 menit.
