BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Bahan yang diidentifikasi pada penelitian ini, yaitu: minyak kayu manis yang merupakan dari tanaman kayu manis diperoleh dari Eteris Nusantara dan telah diuji identitasnya.
Verifikasi minyak kayu manis meliputi:
a. Pengamatan organoleptis. Pengamatan organoleptis berupa pengamatan bentuk, warna dan aroma dari minyak kayu manis yang digunakan sebagai bahan penelitian.
b. Indeks bias. Indeks bias minyak kayu manis diukur dengan menggunakan hand refractometer. Pentutup prisma di buka kemudian minyak kayu manis diteteskan 1 atau 2 tetes sampel pada prisma utama, penutup
prisma di tutup perlahan sampai menyentuh prisma utama. Skala 1, 2 atau 3 diatur dengan memutar knob.
Berikut adalah jarak jangkauan: 1: 1,333 – 1,404 (skala sebelah kiri) 2: 1,404 – 1,468 (skala tengah)
3: 1,468 – 1,520 (skala sebelah kanan)
Ujung refraktor diarahkan ke arah cahaya yang terang, dilihat melalui lensa sambil diputar-putar sampai skala terlihat jelas. Tampak garis batas yang memisahkan sisi yang terang dan gelap pada bagian atas dan bawah. Jika garis batas berwarna atau tidak jelas, maka ring diputar untuk menghilangakan warna hingga batas terlihat jelas.
c. Bobot Jenis. Piknometer 10 mL ditimbang dalam keadaan kosong dan bersih. Piknometer 10 mL diisi air suling. Suhu diturunkan hingga 23°C kemudian dinaikkan perlahan hingga 25°C. Permukaan air diatur sampai puncak kapiler kemudian pipa kapiler ditutup. Setelah mencapai suhu kamar, dinding luar piknometer diusap dan ditimbang. Hal yang sama dilakukan pada minyak kayu manis. Bobot jenis minyak kayu manis sama dengan kerapatan minyak kayu manis dibagi kerapatan air pada suhu 25°C.
2. Sterilisasi peralatan dan media
Peralatan yang digunakan dalam penelitian, terutama yang berhubungan dengan bakteri uji seperti: tabung reaksi dan cawan petri, disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 20
menit dengan tekanan 1 atm dan khusus untuk pipet ukur disterilisasi dengan menggunakan oven pada suhu 50°C selama 20 menit.
3. Penyiapan media uji
Media yang digunakan ada 2 macam yaituTrypton Soya Agar(TSA) danTrypton Soya Broth(TSB). Pemilihan kedua media tersebut adalah terkait agar Streptococcus mutans dapat tumbuh, pada media yang sesuai. Pembuatan media TSA yaitu dengan mencampurkan serbuk TSA sebanyak 24 gram dengan aquadest sebanyak 600 mL. Pembuatan media TSB yaitu dengan mencampurkan serbuk TSB sebanyak 1,8 gram dengan aquadest sebanyak 60 mL, kedua jenis media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Media TSA yang telah disterilkan dibiarkan memadat dalam kondisi miring untuk reisolasi bakteri Streptococcus mutans.
4. Pembuatan suspensi bakteri
Diambil 1-3 ose dari stok bakteri Streptococcus mutans, diinokulasikan ke dalam 5 mL TSB dan divortex, diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Suspensi bakteri uji disetarakan dengan larutan standar Mc Farland 0.5, jika kekeruhannya melebihi kekeruhan Mc Farland 0.5, maka dilakukan penambahan media TSB steril sampai didapat kekeruhan yang sama.
5. Penanaman isolatStreptococcus mutanssecara pour plate
Suspensi bakteri diinokulasikan sebanyak 0,2 mL pada media TSA steril cair. Media yang telah memadat dilubangi menggunakan pelubang
sumuran dengan diameter 7 mm secara aseptis sebagai tempat kontrol negatif, dan minyak kayu manis dengan berbagai variasi konsentrasi.
6. Pembuatan uji dilusi padat konsentrasi (4 - 10%)
Pembuatan media TSA yaitu dengan mencampurkan TSA 9 gram dengan aquadest 225 mL. Pembuatan media TSB yaitu dengan mencampurkan serbuk TSB sebanyak 0,6 gram dengan aquadestsebanyak 20 mL, media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Tabung reaksi yang telah diisi dengan media TSA steril 15 mL, diinokulasikan sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri Streptococcus mutans yang telah disetarakan dengan larutan Mc Farland 0.5. Di masukkan sebanyak 0,2 mL minyak kayu manis dengan konsentrasi 4-10%, tuang ke dalam petri steril. Diinkubasi selama 24 jam, bandingkan kekeruhan media uji dengan kontrol pertumbuhan, pelarut dan media yang menunjukkan kepadatan pertumbuhan bakteri uji. Diberi penilaian menggunakan notasi (+) untuk media yang tampak keruh dan (-) untuk media yang tampak jernih. Hasil pengamatan dianalisis untuk mendapatkan konsentrasi (KHM dan KBM) minyak kayu manis.
7. Uji penegasan (streak plate) konsentrasi (6 - 9%)
Media TSA 1,33 gram dicampur denganaquadest 33 mL. Diautoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Petri dibagi menjadi 2 bagian, untuk mempermudah penyetrikkan. Diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C, kemudian diamati daya hambat yang dihasilkan pada konsentrasi (6 - 9%).
Bila ditemukan adanya pertumbuhan, dilakukan kembali uji penegasan kedua dengan melakukan penyetrikkan dari uji penegasan pertama pada media baru secara streak plate. Diinkubasi kembali selama 24 jam dengan suhu 370C, kemudian tentukan konsentrasi atau Kadar Bunuh Minimum (KBM) minyak kayu manis.
8. Pembuatan sediaan pasta gigi minyak kayu manis a. Formula pasta gigi
Perhitungan penimbangan bahan-bahan yang digunakan dapat di lihat pada Lampiran 8.
Tabel III. Formula pasta gigi untuk 100 gram
Bahan (g) F1 F2 F3 F4 F5 F6
Natrium karboksimetil selulosa Sorbitol
Gliserin
Kalsium karbonat Silitol
Natrium lauril sulfat Metil Paraben Minyak permen Aquadest
Minyak kayu manis
0,5 17 21 43 1 0,8 0,2 4 4,5 8 0,5 17,5 21 43 1 0,8 0,2 4 4,5 8 0,5 18 21 43 1 0,8 0,2 4 4,5 8 0,5 18,5 21 43 1 0,8 0,2 4 4,5 8 0,5 19 21 43 1 0,8 0,2 4 4,5 8 0,5 19,5 21 43 1 0,8 0,2 4 4,5 8
b. Cara pembuatan pasta gigi
Natrium karboksimetil selulosa didispersikan kedalam gliserin dan ditambah aquadest. Dicampur sebagian gliserin dengan minyak kayu manis, minyak permen dan metil paraben dalam beker, aduk homogen. Sisa gliserin dilarutkan ke dalam natrium lauril sulfat diaduk sampai larut. Campuran gliserin, minyak kayu manis, minyak permen dan metil paraben ditambahkan ke dalam natrium karboksimetil selulosa. Ditambahkan
sorbitol dan digerus sampai homogen. Sebagian CaCO3 ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam mortir sampai campuran homogen. Campuran natrium lauril sulfat dan gliserin dimasukkan ke dalam mortir dan ditambahkan sedikit demi sedikit dengan CaCO3 dan dicampurkan silitol ke dalam mortir.
c. Uji sifat fisik dan stabilitas pasta gigi
1) Uji organoleptis dan stabilitas organoleptis
Melakukan uji organoleptis (bau, warna, tekstur dan homogenitas) terhadap pasta gigi pada 48 jam, 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu dan 4 minggu.
2) Uji pH dan stabilitas pH
Melakukan uji pH setelah pembuatan pasta gigi selesai dengan menggunakan indikator pH. Uji ini dilakukan 48 jam setelah pembuatan untuk mengetahui efek faktor terhadap pH sedangkan untuk memonitor perubahan pH, dilakukan uji pada 48 jam, 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu dan 4 minggu.
3) Uji daya lekat dan stabilitas daya lekat
Uji daya lekat dilakukan dengan cara 0,25 gram pasta gigi diletakkan di atas dua object glass yang telah ditentukan, kemudian ditekan dengan beban 1 kg selama 1 menit. Setelah itu dipasangobject glass pada alat uji lalu ditambahkan beban 80 gram pada alat uji, kemudian dicatat waktu pelepasan pasta dari object glass (Voigh, 1995).
Uji ini dilakukan 48 jam setelah pembuatan untuk mengetahui efek faktor terhadap daya lekat, sedangkan untuk memonitor perubahan daya lekat, dilakukan uji pada 48 jam, 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu dan 4 minggu.
4) Uji viskositas dan stabilitas viskositas
Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscometer RION seri VT 04. Pasta gigi dimasukan ke dalam wadah hingga penuh dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas pasta gigi diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Uji ini dilakukan 48 jam setelah pembuatan untuk mengetahui efek faktor terhadap viskositas, sedangkan untuk memonitor perubahan viskositas, dilakukan uji pada 48 jam, 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu dan 4 minggu.
9. Uji daya antibakteri pasta gigi minyak kayu manis terhadap Streptococcus mutansdengan difusi sumuran
Pembuatan media TSA yaitu dengan mencampurkan serbuk TSA sebanyak 32 gram denganaquadestsebanyak 800 mL. Pembuatan media TSB yaitu dengan mencampurkan serbuk TSB sebanyak 1,5 gram denganaquadest sebanyak 50 mL, kedua jenis media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Media yang telah berisi suspensi bakteri Streptococcus mutans, dibiarkan memadat. Tiap petri berisi 4 lubang sumuran diantaranya pasta gigi (sampel) sesuai formula, kontrol negatif (basis pasta), kontrol positif (pasta
gigi merek “X”), minyak kayu manis 7% menggunakan spuit injeksi 1 mL masing-masing sebanyak 0,020 mL.
Diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C, kemudian diamati diameter zona jernih yang dihasilkan. Diameter zona hambat yang dihasilkan diukur dengan penggaris, kemudian dikurangi diameter sumuran yang digunakan, yakni 7 mm. Daya antibakteri diamati berdasarkan diameter zona hambat yang terbentuk dibandingkan dengan kontrol negatif. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk tiap formula pasta gigi.
10. Uji iritasi pasta gigi minyak kayu manis
Dilakukan penimbangan mukus, slug dipilih dan ditimbang dengan berat antara 3-4 gram. Petri kosong ditimbang dan ditambah dengan 500 mg sampel, kemudian petri dan sampel tersebut ditimbang kembali. Slug diletakkan di atas sampel dan didiamkan selama 30 menit. Slug kemudian dibersihkan dari mukus. Mukus yang terdapat pada petri ditimbang. Mukus yang diproduksi (MP) dihitung dengan rumus:
MP = ( )
( ) × 100% (1)
MP tersebut diklasifikasikan menjadi:
1) Tidak mengiritasi (non irritating), bila produksi mukus <15% 2) Mengiritasi ringan (mild), bila produksi mukus 15-20% 3) Mengiritasi sedang (moderate), bila produksi mukus 20-25%
4) Mengiritasi berat (severe), bila produksi mukus >25% (Adriaens, 2006).
