BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Teh hijau yang digunakan adalah daun dari tanaman teh (Camelia sinensis L.) dari PT Rumpun Sari Medini Boja Kendal Jawa Tengah yang tidak mengalami fermentasi dalam pengolahannya. Identifikasi teh hijau dilakukan oleh PT Rumpun Sari Medini Boja Kendal Jawa Tengah yang menyatakan bahwa daun yang digunakan adalah benar daun teh (Camelia sinensis L.) yang diolah menjadi teh hijau.
2. Pembuatan serbuk teh hijau
Proses pembuatan serbuk teh hijau dilakukan oleh Lembaga Pusat Penelitian Terpadu (LPPT) UGM dengan mesin penyerbuk dengan saringan berdiameter 1 mm.
3. Pembuatan infusa teh hijau
Penyarian teh hijau dilakukan dengan metode infundasi berdasarkan CoA yang dilakukan oleh LPPT UGM.
4. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dengan cara maserasi
Penyarian teh hijau dilakukan dengan metode maserasi berdasarkan CoA yang dilakukan oleh LPPT UGM.
5. Pembuatan formula standar pasta gigi dan formula modifikasi pasta gigi Tabel I. Formula standar pasta gigi (Young, 1972).
Bahan pasta gigi Satuan (g)
Kalsium karbonat 57
Natrium lauril sulfat 1
Gliserin 21
Tragakan 1,5
Pewarna 1 tetes
Natrium sakarin 1 tetes
Aquadest 19,5
Natrium benzoate 1 mikrospatula
a. Formula pasta gigi infusa teh hijau
Tabel II. Formula modifikasi pasta gigi infusa teh hijau (100 g)
Bahan pasta gigi Satuan (g)
CMC-Na 1,5 Kalsium karbonat 40 Gliserin 11 Metil Paraben 0,2 Natrium sakarin 0,25 Aquadest Etanol 35,05 1 mL
b. Formula pasta gigi ekstrak etanol teh hijau
Tabel III. Formula modifikasi pasta gigi ekstrak etanol teh hijau (100 g)
Bahan pasta gigi Satuan (g)
CMC-Na 1,5 Kalsium karbonat 40 Gliserin 11 Metil Paraben 0,2 Natrium sakarin 0,25 Aquadest Etanol 35,05 1 mL
Ekstrak etanol teh hijau 10 mL
6. Pembuatan pasta gigi infusa teh hijau
Pembuatan pasta gigi dilakukan dengan cara membuat basis pasta terlebih dahulu. Basis pasta yang digunakan adalah CMC-Na. CMC-Na dikembangkan dalam 30 mL aquadest selama 24 jam. Setelah mengembangkan CMC-Na, gliserin dimasukkan dalam wadah dan diaduk menggunakan mixer dengan kecepatan putar nomor 2 selama 10 menit. Metil paraben dilarutkan dalam 1 mL etanol dan natrium sakarin dan infusa teh hijau masing-masing dilarutkan dalam aquadest panas. Larutan metil paraben ditambahkan pada campuran CMC-Na dan gliserin, lalu diaduk menggunakanmixerdengan kecepatan putar nomor 2 selama 5 menit. Setelah itu, larutan natrium sakarin dan kalsium karbonat ditambahkan sedikit demi sedikit, serta diaduk secara perlahan selama 5 menit untuk menghomogenkan campuran. Pada tahap akhir ditambahkan larutan infusa teh hijau sebanyak 10 ml dan aduk selama 5 menit sampai homogen (Young, 1972). 7. Pembuatan pasta gigi ekstrak etanol teh hijau
Pembuatan pasta gigi dilakukan dengan cara membuat basis pasta terlebih dahulu. Basis pasta yang digunakan adalah CMC-Na. CMC-Na dikembangkan
dalam 30mL aquadest selama 24 jam. Setelah mengembangkan CMC-Na, gliserin dimasukkan dalam wadah dan diaduk menggunakan mixer dengan kecepatan putar nomor 2 selama 10 menit. Metil paraben dilarutkan dalam 1mL etanol, sedangkan natrium sakarin dan ekstrak etanol teh hijau masing-masing dilarutkan dalam aquadest panas. Larutan metil paraben ditambahkan pada campuran CMC-Na dan gliserin, lalu diaduk menggunakanmixerdengan kecepatan putar nomor 2 selama 5 menit. Setelah itu, larutan natrium sakarin dan kalsium karbonat ditambahkan sedikit demi sedikit, serta diaduk secara perlahan selama 5 menit untuk menghomogenkan campuran. Pada tahap akhir ditambahkan 10 mL larutan ekstrak etanol teh hijau dan aduk selama 5 menit sampai homogen (Young, 1972). 8. Uji daya antibakteri pasta gigi infusa dan ekstrak etanol teh hijau
terhadapStreptococcus mutans
a. Pembuatan variasi konsentrasi infusa teh hijau
Berdasarkan Certificate of Analysis dari LPPT UGM variasi konsentrasi katekin (EGCG) infusa teh hijau yang didapatkan yaitu 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5 ; 5; dan 7,5 mg/ mL dengan volume 14 mL. Dalam penelitian ini diambil 2 dari 7 variasi konsentrasi, yaitu konsentrasi 5 dan 7,5 mg/mL. Pada penelitian Praktikno (2003), katekin dalam teh hijau yang disari dengan menggunakan metode infundasi memiliki daya antibakteri dengan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) sebesar 0,5 mg/mL. Berdasarkan penelitian di atas, senyawa uji dengan konsentrasi katekin 5 dan 7,5 mg/mL dilakukan pengenceran sehingga menjadi konsentrasi katekin sebesar 0,2; 0,3; 0,4; dan 0,5 mg/g dalam pasta gigi infusa teh hijau (Tabel IV).
Tabel IV. Variasi konsentrasi katekin dalam infusa teh hijau Konsentrasi katekin (EGCG) awal infusa teh hijau (mg/mL) Infusa teh hijau yang diambil (mL) Aquadest steril (mL) Volume pengenceran (mL) Volume penambahan infusa teh hijau dalam pasta gigi
(ml) Konsentrasi katekin (EGCG) akhir dalam pasta gigi (mg/g) 5 4 6 10 10 0,2 5 6 4 10 10 0,3 7,5 5,33 4,67 10 10 0,4 7,5 6,67 3,33 10 10 0,5
b. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau
Berdasarkan Certificate of Analysis dari LPPT UGM variasi konsentrasi katekin (EGCG) ekstrak etanol teh hijau yang didapatkan yaitu 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5 ; 5; 7,5 dan 10 mg/ mL dengan volume 14 mL. Dalam penelitian ini diambil 2 dari 7 variasi konsentrasi, yaitu konsentrasi 5 dan 10 mg/mL dan dilakukan pengenceran sehingga menjadi konsentrasi katekin sebesar 0,2; 0,3; 0,4; dan 0,5 mg/g dalam pasta gigi ekstrak etanol teh hijau. Variasi konsentrasi katekin (EGCG) ekstrak etanol teh hijau dibuat sama dengan variasi konsentrasi katekin (EGCG) infusa teh hijau agar dapat dibandingkan daya antibakteri pasta gigi infusa teh hijau dengan pasta gigi ekstrak etanol teh hijau dalam menghambat pertumbuhanStreptococcus mutans(Tabel V).
Tabel V. Variasi konsentrasi katekin dalam ekstrak etanol teh hijau Konsentrasi EGCG awal ekstrak etanol teh hijau (mg/mL) Ekstrak etanol teh hijau yang diambil (mL) Aquadest steril (mL) Volume pengenceran (mL) Volume penambahan ekstrak etanol teh
hijau dalam pasta gigi (ml)
Konsentrasi EGCG akhir dalam pasta gigi
(mg/g)
5 4 6 10 10 0,2
5 6 4 10 10 0,3
10 4 6 10 10 0,4
c. Penyiapan bakteri uji dan pembuatan media Nutrien Agar (NA)
Bakteri uji yang digunakan adalah S. mutans. Penyiapan bakteri uji ini dilakukan dengan membuat 10 mL suspensi S. mutans menggunakan media Nutrien Broth (NB) dan disetarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi bakteri 6. 108CFU/mL).
Pembuatan media Nutrien Agar (NA) dilakukan dengan menimbang sebanyak 3 gram agar dan 2 gram Nutrien Broth (NB) dilarutkan dalam 125 mL aquadest steril. Larutan dipanaskan dengan sesekali diaduk hingga jernih dan terlarut sempurna. Larutan tersebut kemudian diautoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Media dibiarkan agak dingin dan siap untuk digunakan.
d. Pengujian daya antibakteri pasta gigi infusa dan pasta gigi ekstrak etanol teh hijau secara difusi sumuran
Petri berisi 20 mL media nutrient agar (NA) disiapkan. Pembuatan kontrol kontaminasi media dilakukan dengan cara : petri berisi media NA secara aseptis dibuat sumuran dengan pelobang sumuran diameter 6 mm. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji dilakukan dengan cara : menginokulasikan 0,1 mL suspensi bakteri uji yang sudah disetarakan dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi bakteri 6. 108 CFU/mL), lalu diinokulasikan ke dalam tabung berisi media NA pada suhu 45-50C, kemudian isi tabung dituang ke dalam petri secara pour plate. Untuk uji kontrol negatif (basis pasta gigi), uji kontrol positif (EGCG 5mg/mL) dan pengujian daya antibakteri infusa dan ekstrak etanol teh hijau dilakukan dengan pembuatan sumuran pada media yang dibuat dengan
menggunakan mediadouble layer, di mana sebanyak 5 mL media NA dituang ke dalam petri sebagai base layer dan dibiarkan memadat. Kemudian sebanyak 0,1 mL suspensi bakteri S. mutans diinokulasikan ke dalam 15 mL media NA pada suhu 45-50C secara pour plate pada petri. Kemudian secara aseptis dibuat sumuran sampai batas antara lapisan atas dan bawah. Sumuran dibuat sebanyak 3 lobang pada 2 petri. Pada petri I, sebanyak 50 µl pasta gigi yang mengandung senyawa uji dengan 2 variasi konsentrasi senyawa uji (konsentrasi 0,2 ; 0,3 mg/g) dan kontrol negatif diinokulasikan pada media menggunakan mikropipet, sedangkan pada petri II sebanyak 50 µl pasta gigi yang mengandung senyawa uji dengan 2 variasi konsentrasi senyawa uji (konsentrasi 0,4; 0,5 mg/g) dan kontrol positif (EGCG 5 mg/mL) diinokulasikan pada media menggunakan mikropipet. Setelah itu, media diinkubasi selama 24 jam pada suhu ± 37C. Setelah 24 jam, diamati zona hambat di setiap petri. Diameter zona hambat yang dihasilkan diukur dengan penggaris kemudian dikurangi diameter sumuran yang digunakan yaitu 6 mm. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk tiap konsentrasi katekin (EGCG) dalam pasta gigi
9. Uji Sifat Fisik Pasta Gigi
Evaluasi sifat fisik pasta gigi infusa teh hijau dan ekstrak etanol meliputi warna, bau, pH, viskositas dansag.
a. Warna dan bau
Uji organoleptis merupakan uji dengan menggunakan indera manusia sebagai instrumennya. Pengujian organoleptis dilihat dari warna dan aroma yang ditimbulkan. Warna diuji dengan menuangkan sediaan pada wadah dan melihat
warna yang dihasilkan sesuai dengan spesifikasi yang diinginkan. Aroma diuji dengan cara mencium sediaan tersebut yang menghasilkan aroma teh. Pada pengujian ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan diukur pada rentang waktu penyimpanan 48 jam, 7 hari, dan 35 hari.
b. pH
Pengukuran pH dilakukan dengan cara mencelupkan kertas indikator sampai batas celupan, lalu didiamkan beberapa saat hingga terjadi perubahan warna. Kemudian membandingkan perubahan warna yang terjadi dengan warna indikator pH. Pada pengujian ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan diukur pada rentang waktu penyimpanan 48 jam, 7 hari, dan 35 hari.
c. Viskositas
Pengukuran viskositas pasta gigi dilakukan dengan menggunakan viskometer.Spindel dipasang pada gantungan spindel dan diturunkan sedemikian rupa sehingga batas spindel tercelup ke dalam cairan sampel yang akan diukur viskositasnya. Setelah itu, sampel dimasukan ke dalam wadah ± 100 mL. Rotor dinyalakan dan spindel dibiarkan berputar sambil melihat jarum merah pada skala. Viskositas dihitung dengan mengkonversi nilai viskositas yang telah ditetapkan dengan skala pada spindel. Pada pengujian ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan diukur pada rentang waktu penyimpanan 48 jam, 7 hari, dan 35 hari (Liebermannet al., 1996).
d. Sag
Sagadalah ketidakmampuan pasta gigi untuk mempertahankan bentuknya (diameter silinder pasta gigi) selama 1 menit setelah pasta gigi tersebut
dikeluarkan dari dalam tube. Pasta gigi harus dapat mempertahankan bentuknya ketika dikeluarkan dari tube. Ketika diaplikasikan pada sikat gigi, pasta gigi seharusnya tidak masuk ke sela bulu sikat. Sifat ini dapat dievaluasi secara visual dengan cara pasta gigi dimasukkan ke dalam tube pasta gigi. Setelah itu, pasta gigi dikeluarkan dengan cara menekan bagian ujung tube pasta gigi pada kaca bundar berskala. Kemudian dilakukan pengamatan terhadap diameter awal silinder pasta gigi dan diameter silinder pasta gigi setelah 1 menit. Pada pengujian ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan diukur pada rentang waktu penyimpanan 48 jam, 7 hari, dan 35 hari (Garlen, 1996).