a. Penetapan kadar air serbuk teh hitam. Penetapan kadar air serbuk teh hitam dilakukan dengan menggunakan metode Karl Fischer. Serbuk teh hitam ditimbang 1 gram, ditambah 10 mL metanol, lalu didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan pre-titrasi pada alat dan uji kebocoran alat, hingga didapat angka drift 10-50. Standarisasi dilakukan dengan cara menimbang
spuit berisi air, kemudian dimasukkan 1 tetes air ke dalam alat. Spuit ditimbang
kembali untuk menentukan berat air yang dimasukkan. Kesetaraan air dihitung. Metanol dimasukkan sebanyak 1 mL dan dititrasi dengan alat (blanko). Kadar air dihitung. Sampel dimasukkan 1 mL, dititrasi dengan alat, dan dihitung kadar air dalam sampel. Kadar air dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus:
Kadar air = − ×100% ditimbang yang berat blanko x ...(2) x = angka yang muncul pada alat (mg)
b. Ekstraksi polifenol dari teh hitam. Serbuk teh(100 g, kadar air < 10%) diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol (500 mL) dengan bantuan shaker (150 rpm) selama 48 jam. Ekstrak metanol yang diperoleh diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sampai volume 100 mL. Selanjutnya ditambahkan 100 mL kloroform dan 100 mL aquades. Lapisan atas dan lapisan bawah dipisahkan. Selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat dua kali, masing-masing dengan volume 150 mL. Ekstrak polifenol yang ada di bagian atas dikumpulkan, selanjutnya diuapkan hingga kering (Nagayama, Iwamura, Shibata,
2. Penetapan kadar polifenol teh hitam dalam ekstrak kering polifenol secara Kolorimetri (metode Folin Ciocalteau)
a. Penentuan operating time. Sebanyak 0,05 g kuersetin standar dilarutkan dengan 75% aseton sampai volume 50,0 mL. Dibuat konsentrasi 0,4 mg/mL menggunakan aseton 75%. Diambil 0,5 mL larutan tersebut dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL. Ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteau sebanyak 2,5 mL dan dibiarkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL larutan Na2CO3 kemudian diencerkan dengan aquades hingga tanda sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,4 mg% b/v. Larutan divortex selama 30 detik kemudian diinkubasi selama 40 menit. Kemudian disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 726,0 nm. Dicari operating time yang memberikan serapan yang stabil.
b. Penentuan panjang gelombang (λ) maksimum. Sebanyak 0,05 g kuersetin standar dilarutkan dengan 75% aseton sampai volume 50,0 mL. Dibuat konsentasi 0,4 mg/mL menggunakan aseton 75%. Diambil 0,5 mL larutan tersebut dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL. Ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteau sebanyak 2,5 mL dan dibiarkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL larutan Na2CO3 kemudian diencerkan dengan aquades hingga tanda sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,4 mg% b/v. Larutan divortex selama 30 detik kemudian diinkubasi selama 40 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 600-800 nm. Kemudian dapat ditentukan panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum.
c. Penetapan kurva baku. Sebanyak 0,05 g kuersetin standar dilarutkan dengan 75% aseton sampai volume 50,0 mL. Dibuat seri konsentasi 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; dan 0,7 mg/mL menggunakan aseton 75%. Diambil 0,5 mL larutan tersebut dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL.Ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteau sebanyak 2,5 mL dan dibiarkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL larutan Na2CO3 kemudian diencerkan dengan aquades hingga tanda sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; dan 0,7 mg% b/v. Larutan divortex selama 30 detik kemudian diinkubasi selama 40 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit.Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
d. Penetapan kadar polifenol ekstrak kering polifenol teh hitam. Sebanyak kurang lebih seksama 500 mg ekstrak kering polifenol teh hitam dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, kemudian dilarutkan dengan aseton 75% dan diencerkan hingga tanda. Sebanyak 1 mL larutan tersebut diambil kemudian dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan diencerkan dengan aquades hingga tanda.Diambil 0,5 mL larutan tersebut dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL. Ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteau sebanyak 2,5 mL dan dibiarkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL larutan Na2CO3 kemudian diencerkan dengan aquades hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik kemudian diinkubasi selama 40 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali. Kadar polifenol dalam sampel dihitung menggunakan
persamaan kurva baku sehingga diperoleh konsentrasi polifenol total terhitung ekuivalen terhadap kuersetin.
3. Penentuan nilai SPF secara in vitro
a. Pembuatan larutan stok polifenol teh hitam. Ekstrak kering polifenol teh hitam ditimbang setara dengan 25 mg polifenol teh hitam (50 mg ekstrak kering) dan dilarutkan dengan etanol 90% dalam labu ukur 100 mL. Larutan diencerkan hingga tanda sehingga diperoleh larutan stok polifenol teh hitam dengan konsentrasi 25 mg% b/v.
b. Penentuan spektra absorpsi UV polifenol teh hitam. Larutan stok diambil sebanyak 2,4 mL dan diencerkan dengan etanol 90% dalam labu ukur 10 mL sehingga diperoleh konsentrasi 6 mg% b/v. Spektra UV larutan diperoleh dengan scanning absorbansi larutan pada panjang gelombang 250-400 nm.
c. Penentuan nilai SPF. Larutan stok diambil sebanyak 2,4 dan 3 mL dan diencerkan dengan etanol 90% dalam labu ukur 10 mL sehingga diperoleh konsentrasi 6 dan 7,5 mg% b/v. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk tiap konsentrasi.
Absorbansi masing-masing konsentrasi diukur tiap 5 nm pada rentang panjang gelombang 290 nm hingga panjang gelombang tertentu di atas 290 nm yang mempunyai nilai serapan 0,050. Dibuat kurva antara nilai absorbansi terhadap panjang gelombang. Luas daerah di bawah kurva (AUC) antara dua panjang gelombang yang berurutan dihitung dengan rumus trapezium:
AUC = [ ( )] 2 ) ( a p p Ap a p A − − + − λ λ ...(3)
Keterangan rumus di atas adalah:
A(p-a) = absorbansi pada panjang gelombang yang lebih rendah diantara dua panjang gelombang yang berurutan.
Ap = absorbansi pada panjang gelombang yang lebih tinggi diantara dua panjang gelombang yang berurutan.
λ(p-a) = panjang gelombang yang lebih rendah diantara dua panjang gelombang berurutan.
λp = panjang gelombang yang lebih tinggi diantara dua panjang gelombang berurutan.
Seluruh luas daerah di bawah kurva absorbansi dapat dihitung dengan menjumlahkan semua harga AUC. Harga Sun Protection Factor (SPF) dapat dihitung dengan rumus :
Log SPF = 1 λ λn− AUC ...(4) Keterangan rumus di atas adalah:
λn = panjang gelombang terbesar diantara panjang gelombang 290 nm hingga di atas 290 nm yang mempunyai nilai absorbansi 0,050.
λ1 = panjang gelombang terkecil (290 nm).
4. Optimasi proses pembuatan gel
a. Formula gel sunscreen menurut A Formulary of Cosmetic Preparation (1977)
Ethanol (SD-40) 48,0
Carbopol 940 1,0
Escalol 106 (Glyceryl-p-amino benzoate) 3,0
Monoisopropilamine 0,09
Aquadest 47,91
Parfume 9,5
Dalam optimasi formula ini dilakukan modifikasi formula dengan variasi perbandingan komposisi humectant.
R/ Etanol 96% 10 mL Sorbitol 5 – 15 gram PEG 400 5 – 15 gram Carbopol 3% b/v 30 gram Aquadest 35 mL Triethanolamin sampai pH 5-6
Ekstrak kering polifenol teh hitam 0,015 % b/b terhadap basis
Tabel II. Formula Desain Faktorial Formula 1 a b ab Etanol 96% 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL Sorbitol 5 g 15 g 5 g 15 g PEG 400 5 g 5 g 15 g 15 g Carbopol 3% b/v 30 g 30 g 30 g 30 g Aquadest 35 mL 35 mL 35 mL 35 mL Triethanolamin sampai pH 5 - 6
Ekstrak kering polifenol
teh hitam 15,50 mg 17,35 mg 17,35 mg 19,20 mg Vitamin C 0,01 g 0,01 g 0,01 g 0,01 g
b. Pembuatan gel
Sorbitol dan PEG 400 dicampurkan dengan bantuan magnetic strirer
kecepatan 700 rpm selama 10 menit. Campuran sorbitol-PEG 400 dimasukkan ke dalam Carbopol 3% b/v, dimixer (400 rpm) selama 5 menit. Vitamin C yang telah dilarutkan dalam 20 mL aquadest dan aquadest sisa dimasukkan dalam campuran, dimixer (400 rpm) selama 5 menit. Triethanolamin dimasukkan tetes demi tetes hingga pH 5-6. Fraksi yang telah dilarutkan di dalam etanol dimasukkan. Dimixer dengan kecepatan 400 rpm hingga total pencampuran dari awal sampai akhir selama 15 menit.
5. Uji sifat fisik dan stabilitas gel sunscreen fraksi polifenol teh hitam a. Uji daya sebar.
Pengukuran daya sebar dilakukan 48 jam setelah pembuatan dan 30 hari setelah penyimpanan (Garg, Aggarwal, Singla, 2002). Gel ditimbang seberat 1,0 gram, diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di atas gel diletakkan kaca bulat lain dan pemberat sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit. Pengukuran dilakukan dengan mengukur rata-rata dari dua diameter penyebaran (Garg et al., 2002). Pengukuran diulangi 6 kali.
b. Uji viskositas dan pergeseran viskositas.
Pengukuran viskositas menggunakan alat viscotester seri VT 04 (Rion-Japan) dengan cara : gel dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable
viscotester. Viskositas gel diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk
viskositas (Instruction Manual Viscotester seri VT 04). Untuk mengetahui pergeseran viskositas uji ini dilakukan dua kali, yaitu 48 jam, dan 30 hari setelah pembuatan gel.
6. Subjective Assessment
Subjective assessment dilakukan dengan membuat kuesioner untuk
memperoleh data tentang tingkat penerimaan konsumen terhadap formula gel
sunscreen ekstrak kering polifenol teh hitam. Kuesioner disebarkan kepada 30
responden. Hasil subjective assessment diinterpretasikan sebagai tingkat penerimaan konsumen terhadap formula gel sunscreen ekstrak kering polifenol teh hitam.
