Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian akan dilaksanakan dari bulan Januari – Maret 2016. Pembuatan ekstrak dan pengujian fitokimia daun Kecombrang di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara. Pengujian efektivitas antifungi di Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan I. Pengujian LC50 dilakukan di Laboratorium Budidaya Perairan Manajemen Sumberdaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah kamera digital, alat tulis, pisau, cawan petri, laminar air flow, pipet tetes, mikropipet, gelas ukur, toples kaca, corong, tabung reaksi, botol vial, beaker glass, rak tabung, spatula, inkubator, penangas air (water bath), jarum ose, rotary evaporator, labu Erlenmeyer, blender, aluminium foil, plat TLC, kapas, kertas cakram, api bunsen, kertas saring, vortex, spreader, refrigerator, oven, cotton bud, timbangan analitik, autoklaf, hot plate, pinset, magnetic stirrer, akuarium ukuran 40 cm x 40 cm x 30 cm sebanyak 12 buah, aerator sebanyak 4 buah, DO meter, Termometer, dan pHmeter.
Bahan yang digunakan adalah pelarut N-heksana (non polar), Etil asetat (semi polar), metanol (polar), Daun Kecombrang, akuades steril, alkohol 70%, spirtus, biakan jamur Saprolegnia sp. diperoleh dari Balai Karantina Kelas I Medan I laboratorium Penyakit Kualanamu, besi (III) klorida (FeCl3) 1%, cerium sulfat (CeSO4) 1%, pereaksi Dragendorf, pereaksi Bouchardat, pereaksi Mayer,
pereaksi Wagner, standar triterpenoid dan ß-sitosterol, HCl 2 N, air laut, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Potato Dextrose Agar (PDA), nistatin, larutan Mc.
Farland 0.5, larutan NaCl 0,9 %, dan benih ikan gurami berukuran 7 – 10 cm sebanyak 150 ekor.
Prosedur Kerja
Persiapan dan Ekstraksi Daun Kecombrang
Daun Kecombrang dikumpulkan sebanyak 9 kg dalam berat kering dari habitat hidup tumbuhan ini daerah Padang Sidempuan, Sumatera Utara.
Pemanenan daun kecombrang diambil daun yang masih muda atau 3 atau 4 helai sebelum pucuk daunnya dan hanya dilakukan pada tumbuhan dengan diameter 15 cm. Daun kecombrang dicuci dengan air mengalir dan dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan selama 7 hari dengan cara diangin-anginkan untuk mengurangi penguapan yang mengikutkan senyawa yang terkandung di dalamnya. Proses pengeringan ini bertujuan menurunkan kadar air sehingga tidak mudah ditumbuhi kapang dan bakteri serta menghilangkan aktivitas enzim yang dapat menguraikan lebih lanjut kandungan zat aktif yang terdapat di kulit batang tumbuhan tersebut (Gunawan dan Sri, 2004). Daun Kecombrang yang sudah kering selanjutnya dipotong menjadi potongan yang lebih kecil agar mudah dihaluskan dengan blender hingga berbentuk serbuk. Serbuk selanjutnya diayak menggunakan ayakan hingga diperoleh serbuk yang halus dan seragam. Serbuk hasil ayakan sebanyak 1,47 kg kemudian disimpan ke dalam stoples kaca karena tidak langsung digunakan untuk proses selanjutnya.
Langkah selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Ekstraksi merupakan suatu proses penarikan komponen atau zat aktif menggunakan pelarut tertentu
(Harborne, 1987). Ekstraksi dalam penelitian ini dilakukan dengan metode maserasi yaitu proses pengambilan senyawa zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam pelarut yang sesuai dengan kepolarannya. Dalam penelitian ini digunakan tiga pelarut dengan kepolaran berbeda yaitu n-heksana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Serbuk sampel masing-masing sebanyak 300 g direndam dengan 1:l pelarut etil asetat dan 1:l pelarut metanol dan sebanyak 870 g direndam dengan 1,5:l n-heksana di dalam labu erlenmeyer. Labu erlenmeyer yang berisi rendaman tersebut kemudian ditutup dengan alumunium foil selama 24 jam sambil sesekali diaduk untuk mempercepat kontak antara sampel dengan pelarut. Setelah itu sampel disaring dengan kapas sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Filtrat yang diperoleh kemudian pelarutnya dievaporasi menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental dari Kecombrang. Ekstrak kental yang diperoleh tersebut dipekatkan dengan penangas air (water bath) agar seluruh pelarutnya habis menguap dan diperoleh ekstrak pekat/kering. Ekstrak tersebut kemudian disimpan di dalam botol vial tertutup.
Uji daya hambat ekstrak Kecombrang terhadap Saprolegnia sp.
Peremajaan jamur Saprolegnia sp. dilakukan dengan mengambil potongan kecil miselium menggunakan blade dan menanamnya secara aseptis pada media PDA. Setelah itu diinkubasi pada suhu kamar/ambiven selama 2 – 3 hari.
Konsentrasi larutan yang digunakan adalah 20%, 40% dan 60% (b/v). Konsentrasi larutan 60% dibuat dengan cara menimbang ekstrak kecombrang sebanyak 0,60 gram yang kemudian dilarutkan 0,5 ml DMSO sampai dengan 1 ml DMSO.
Konsentrasi larutan 40% dibuat dengan cara menimbang ekstrak kecombrang
sebanyak 0,10 gram dan Konsentrasi larutan 20% dibuat dengan cara menimbang ekstrak kecombrang sebanyak 0,15 gram.
Pengujian aktivitas antifungi dilakukan dengan cara mengambil potongan kecil miselium Saprolegnia sp., dengan bentuk kubus dan menanamkannya di media PDA dengan posisi di tengah. Kertas cakram yang telah berisi ekstrak dengan berbagai konsentrasi diletakkan di sekitar potongan jamur tersebut dengan jarak yang sama. Setelah itu diinkubasi pada suhu kamar/ambiven selama 2 – 3 hari.
Penentuan zona hambatan
Untuk aktivitas antifungi ditentukan dengan rumus uji antagonis yaitu dengan mengukur jari-jari pertumbuhan hifa normal dikurang dengan jari-jari pertumbuhan hifa yang terhambat oleh ekstrak (Suryanto dkk., 2011). Perhitungan jari – jari zona hambat jamur Saprolegnia sp. dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Perhitungan jari-jari zona hambat jamur Saprolegnia sp.
Keterangan:
a = Pertumbuhan koloni jamur
b = Zona hambat ekstrak daun Kecombrang terhadap koloni jamur c = Blank disc yang telah berisi ekstrak
d = Letak koloni jamur yang ditanam
x = Koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya
c b a
d
y x
y = Koloni jamur yang pertumbuhannya normal y – x = Jari-jari zona hambat
y = a + bx yang didapatkan dari grafik hubungan antara konsentrasi dengan mortalitas probit menggunakan program Microsoft excel.
Uji Toksisitas Ekstrak Daun Kecombrang Terhadap Ikan Gurami
Uji Toksisitas Ekstrak Daun Kecombrang dengan menguji cobakan secara langsung konsentrasi ekstrak Kecombrang terhadap benih ikan gurami dalam waktu 1 menit dengan kepadatan 10 ekor yang berukuran 7 – 10 cm dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan yakni:
A. Perlakuan kontrol 0 %
B. Perlakuan ekstrak kecombrang 20%, C. Perlakuan ekstrak kecombrang 40%, D. Perlakuan ekstrak kecombrang 60 %, dengan masing-masing sebanyak 3 kali ulangan.
Parameter yang diamati adalah jumlah mortalitas benih ikan gurami terhadap konsentrasi ekstrak Kecombrang yang berbeda dengan tetap menjaga kualitas air tempat hidup ikan uji.
Pengamatan Kualitas Air
Untuk pengukuran parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu menggunakan Thermometer, DO menggunakan DO meter, dan pH menggunakan PH meter. Pengukuran dilakukan setiap hari, pagi dan sore.
Analisis Data
Untuk zona hambat, analisis data menggunakan ms.excel, dan apabila terdapat perbedaan yang nyata analisis data dapat menggunakan ANOVA.