3.1 Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Oleopangan Pusat Penelitian Kelapa Sawit Medan pada bulan Januari 2018 – Mei 2018.
3.2 Jenis Penelitian
Metode penelitian dilakukan secara eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, pembuatan ekstrak dan fraksinasi, isolasi senyawa menggunakan KKt preparatif menggunakan fase gerak forestal dan penampak bercak AlCl3, dilanjutkan uji kemurnian KKt 1 arah dan KKt 2 arah. Isolat yang diperoleh dianalisis dengan spektrofotometer UV, spektrofotometer inframerah, dan Gas Chromatography – Mass Spectrofotometry (GCMS).
3.3 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas yang biasa dipakai di laboratorium, alat penguap vakum putar, blender, botol kaca, cawan porselen, kompor, kertas Whatmann no 1, kuvet, labu alas bulat, lampu UV, neraca analitik, neraca kasar, penangas air, pendingin bola, penyemprot, plastik bening, sirkulator air, Hotplate-Magnetic Stirrer, Spektrofotometer UV, GCMS, Spektroskop Infra Merah, statif dan klem, sudip, tutup karet, vial.
3.4 Bahan
Bahan yang digunakan adalah daun titanus (Leea aequta) dan baha kimia yang digunakan, yaitu: aluminium (III) klorida, asam asetat glasial (Merck), asam klorida pekat (Merck), akuades, etanol (Bratachem), etil asetat (Bratachem), n-butanol, metanol (Merck), n-heksan (Bratachem), kalium Bromida.
3.5 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi tumbuhan, dan pembuatan simplisia daun titanus.
3.5.1 Pengumpulan bahan baku
Sampel yang digunakan adalah daun titanus yang masih segar berwarna hijau (tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda) yang diambil dari Desa Suka Nalu, Kecamatan Barus Jahe, Kabupaten Karo, Provinsi Sumatera Utara. Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain
3.5.2 Identifikasi sampel
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor.
3.5.3 Pengolahan sampel
Sebanyak 6,5 kg daun titanus dibersihkan dari pengotor dengan cara mencuci di bawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan, ditimbang berat basah, dirajang, dikeringkan dalam rak pengering selama 5 hari, disortasi kering, ditimbang berat kering. Sampel dianggap kering apabila sudah rapuh, kemudian sampel diserbukan dan disimpan dalam wadah plastik.
3.6 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.6.1 Pereaksi asam klorida 2 N
Diambil asam klorida pekat sebanyak 83 ml, lalu diencerkan dengan air suling hingga 500 ml.
3.6.2 Pereaksi aluminium klorida 5%
Ditimbang 5 g aluminium klorida, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 100 ml.
3.7 Ekstraksi Simplisia
Sebanyak 600 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah toples kaca bertutup, kemudian dituangkan 4500 ml (75 bagian) etanol ke dalamnya, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, setelah 5 hari disaring, ampas dimasukkan lagi dengan 1500 ml (25 bagian) etanol hingga diperoleh 100 bagian penyari, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari. Hasil maserasi disaring, kemudian dipekatkan dengan alat penguap vakum putar pada suhu 50°C sampai diperoleh ekstrak cukup kental dan dipekatkan di atas penangas air hingga menjadi kental.
3.8 Fraksinasi Cair-Cair
Fraksinasi cair-cair masing-masing dengan pelarut n-heksan dan etil asetat.
Cara kerja:
Sebanyak 20 g ekstrak etanol ditambahkan 40 ml etanol, lalu dilarutkan dengan air panas sebanyak 100 ml, lalu dimasukkan ke dalam corong pisah,
difraksinasi dengan n-heksan sebanyak 100 ml, dilakukan tiga kali, diperoleh lapisan atas (fraksi n-heksan) dan lapisan bawah. Lapisan bawah difraksinasi dengan etil asetat sebanyak 100 ml, dilakukan tiga kali, diperoleh fraksi etil asetat dan fraksi sisa. Fraksi etil asetat dipekatkan hingga menjadi kental (Rohman, 2009).
3.9 Hidrolisis Senyawa Glikosida-Flavonoid
Glikosida flavonoid (1 mg) dihidrolisis dengan 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat 25 ml, kemudian direfluks selama 60 menit. Lalu dipisahkan dengan etil asetat (Markham, 1982).
Ditimbang sebanyak 80 mg fraksi etil asetat daun titanus, dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Ditambahkan 200 ml metanol dan 200 ml HCl 2 N. Direfluks pada suhu 78°C selama 1 jam. Setelah itu didinginkan, lalu dimasukkan ke dalam corong pisah. Ditambahkan 100 ml etil asetat, diekstraksi, dan diambil lapisan atas (lapisan etil asetat). Dilakukan sebanyak 3 kali. Lalu dipekatkan di atas penangas air.
3.10 Isolasi Senyawa Secara Kromatografi Kertas Preparatif
Pemisahan senyawa fraksi etil asetat dengan cara KKt preparatif dilakukan menurut Markham (1982). Untuk KKt preparatif digunakan fase diam kertas Whatmann No. 3.
Fraksi etil asetat daun titanus memberikan pemisahan terbaik dengan menggunakan fase gerak forestal (asam setat : air : HCl pekat = 30 : 10 : 3) dengan penampak bercak AlCl3. (Anugrahwati, 2018).
Cara kerja:
Fraksi etil asetat yang telah dihidrolisis ditotolkan pada kertas Whatmann No.3, kemudian ditotolkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak forestal, dielusi sampai garis tanda, selanjutnya kertas dikeluarkan, dikeringkan, diamati secara visual lalu diamati di bawah sinar UV 366 nm. Pita yang dibentuk diberi tanda dan digunting berupa potongan-potongan kecil, lalu dilarutkan dengan merendamnya dalam metanol selama 24 jam sekali-sekali dikocok dan disaring. Selanjutnya sari dikumpulkan dan dipekatkan.
3.11 Uji Kemurnian terhadap Isolat 3.11.1 Uji kromatografi kertas 1 arah
Uji kemurnian isolat secara satu arah dilakukan dengan KKt menggunakan fase gerak Forestal (asam asetat : air : HCl pekat = 30:10:3).
Isolat ditotolkan pada kertas Whatmann no. 1, kemudian dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan uap fase gerak, dielusi sampai garis tanda, selanjutnya kertas dikeluarkan, dikeringkan dan diamati secara visual, di bawah sinar UV 366 nm.
3.11.2 Uji kromatografi kertas 2 arah
Kromatografi kertas dua arah menggunakan 2 sistem fase gerak yaitu forestal sebagai fase gerak I an BAW sebagai fase gerak II.
Cara kerja:
Isolat ditotolkan pada kertas Whatmann no. 1, lalu dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan uap fase gerak I (forestal), kemudian dielusi sampai tanda batas. Kertas diangkat dan dikeringkan, selanjutnya dielusi kembali
dengan fase gerak II (BAW) dengan arah yang berbeda. Kertas dikeluarkan, dikeringkan, diamati secara visual, di bawah sinar UV 366 nm.
3.12 Analisis Struktur Senyawa Isolat
Struktur senyawa isolat dianalisis dengan spektrofotometer UV dan IR dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU Medan, dan dengan alat GCMS di Pusat Penelitian Kelapa Sawit Medan.
3.12.1 Spektrofotometri UV
Isolat dilarutkan dalam pelarut metanol, kemudian dimasukkan ke dalam kuvet yang telah dibilas dengan larutan sampel. Absorbnsi larutan sampel diukur pada panjang gelombang 200-400 nm (Markham, 1982).
3.12.2 Spektrofotometri Inframerah (IR)
Karakterisasi isolat denga spektrofotometer inframerah dilakukan dengan cara mencampur isolat denga KBr menggunakan alat mixture vibrator, kemudian dicetak menjadi pelet dan dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer inframerah lalu diukur spektrum inframerah pada bilangan gelombang 4000-500 cm-1 (Watson, 2005).
3.12.3 Spektrofotometri Massa
Dilakukan dengan kondisi alat: kolom kapiler DB-5 MS (silika 30 m x 250 μm x 0,25 μm) digunakan pada suhu kolom 50°C (0 menit) hingga 290°C dengan laju 15°C/menit menggunakan gas pembawa helium pada tekanan tetap 7,6411 psi.
BAB IV