BAB III METODE KERJA METODE KERJA
3.3. METODE PENELITIAN
3.3.1. Penelitian secara in vitro
Penelitian secara in vitro dilakukan dalam beberapa tahap yaitu :
a. Tahap Persiapan
Tahapan persiapan penelitian ini meliputi persiapan alat-alat, pembuatan bahan-bahan dan sterilisasi alat serta media yang akan dipakai dalam penelitian.
b. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah
Pengambilan sampel tanah dan pengisolasian bakteri pelarut fosfat asal tanah latosol dilakukan sebagai pembanding terhadap isolat koleksi CV. Meori Agro. Tahapan pengambilan tanah dilakukan dengan mengambil tanah di sekitar rizosfer tanaman jagung kemudian tanah tersebut dikeringudarakan. Kemudian sebanyak 10 gram tanah dari bahan tanah dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi 90 ml larutan fisiologis kemudian dibuat serial pengenceran sampai 10-5. Sebanyak 1 ml dari pengenceran 10-3,10-4 dan 10-5 dituang di cawan petri kemudian media pikovskaya dituangkan secara merata secara steril dan diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu ruang. Koloni-koloni bakteri pelarut fosfat yang diinginkan selanjutnya dimurnikan dan disimpan di dalam medium agar-miring Pikovskaya.
c. Identifikasi Molekuler
Identifikasi molekuler ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut, yaitu isolasi DNA genom bakteri, elektroforesis DNA, Polymerase Chain Reaction (PCR), dan sekuensing DNA.
Isolasi DNA Genom Bakteri. Sebanyak 2 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu ruang di dalam medium NB disentrifugasi (8049,6 x g, 15 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan pelet dicuci dengan 250 µl bufer TE kemudian pelet diresuspensi menggunakan mikropipet. Hasil resuspensi diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit kemudian ditambahkan 50 μl larutan SDS 10% dan dibolak balik. Selanjutnya suspensi kembali diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit kemudian ditambahkan 65 μl NaCl dan 80 µl CTAB-NaCl dan diinkubasi dalam waterbath (65ºC, 20 menit). Pada campuran tersebut kemudian ditambahkan 450
μl kloroform: isoamil (24:1), kemudian tabung Eppendoff yang berisi campuran DNA dibolak-balik secara halus. Suspensi yang telah teremulsi disentrifugasi (6763,9 x g, 15 menit). Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam tabung Eppendoff steril dan ditambahkan isopropanol yang dingin (-20ºC). DNA diendapkan dengan sentrifugasi pada suhu 40
Proses Elektroforesis DNA. Larutan 50x bufer TAE diencerkan menjadi 2x bufer TAE. Kemudian dibuat gel agarosa 1%, yaitu 0,2 gram agarosa dalam 20 ml 2x bufer TAE dan ditambahkan 2 µl Et-Br yang selanjutnya dituang ke dalam cetakan gel agarosa. Setelah gel membeku diletakkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi 1x bufer TAE sehingga gel terendam. Sebanyak 3 μl
dari masing-masing DNA dicampur dengan 1,2 μl loading buffer sebagai pemberat. Suspensi larutan DNA dengan loading buffer diinjeksikan ke dalam
C dengan kecepatan 8049,6 x g selama 20 menit. Supernatan dibuang kemudian dilakukan pencucian menggunakan etanol 70% dingin dan disentrifugasi (8049,6 x g, 2 menit). Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan pelet DNA dikeringudarakan. DNA yang telah didapatkan siap digunakan untuk elektroforesis atau disimpan sebagai stock pada suhu -20ºC.
sumur-sumur pada gel elektroforesis. Setelah semua sumur terisi, power supply perangkat elektroforesis dinyalakan dengan voltase sebesar 75 V selama ± 45 menit. Selanjutnya DNA dapat dilihat dan difoto menggunakan perangkat UV Transilluminator.
Proses Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses PCR diawali dengan pembuatan campuran komponen reaksi untuk PCR sebanyak 50 μl dengan
komposisi sebagai berikut : primer 10 μl 16F27 (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG- 3’), primer 10 μl 16R1492 (5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’), 2 μl template DNA, PCR mix 25 µl dan 19 μl aquabidest steril. Running PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan kondisi sebagai berikut, denaturasi siklus awal atau pra-denaturasi 95ºC selama 5 menit, diikuti denaturasi untuk siklus selanjutnya pada suhu 95ºC selama 1 menit. Penempelan primer (annealing) dilakukan selama 1 menit pada suhu 55ºC. Polimerisasi dilakukan selama 2 menit pada suhu 72ºC dan pada siklus terakhir, yaitu siklus ke-35 dilakukan perpanjangan waktu polimerisasi selama 10 menit. Produk hasil PCR divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.0% dalam 2x bufer TAE dengan voltase 75 volt selama ± 30 menit.
Sekuensing DNA. Produk hasil PCR dikirimkan pada PT. Genetika Science untuk disekuen di Malaysia. Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen pada database European Bioinformatics Institute (EBI) menggunakan piranti FASTA pada situs http://www.ebi.ac.uk.
d. Peremajaan Tiga Isolat Bakteri Koleksi
Ketiga isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro yang akan dipergunakan digoreskan pada media pikovskaya menggunakan jarum ose untuk peremajaan. Perlakuan ini dilakukan di dalam Laminar Air Flow agar tidak terjadi kontaminasi.
e. Pengujian Kualitatif Isolat Bakteri asal Tanah dan Isolat Bakteri
Isolat terpilih dan isolat koleksi yang telah diremajakan kemudian dilakukan pengujian pelarutan P secara kualitatif. Isolat diujikan pada media pikovskaya padat kemudian pengamatan dilakukan sampai terbentuknya zona bening di sekitar bakteri. Koloni yang dikelilingi zona bening menunjukkan adanya pelarutan fosfat. Pengujian secara kualitatif dilakukan dengan cara menghitung besarnya zona bening berbanding besarnya koloni bakteri. Perhitungan pelarutan fosfat pada media menggunakan Indeks pelarutan (IP).
Satu bakteri pelarut fosfat yang unggul selanjutnya disimpan di dalam medium agar-miring Pikovskaya untuk pengujian selanjutnya.
f. Pengujian Kuantitatif Isolat Bakteri
Pengujian Kemampuan Bakteri Koleksi dan Asal Tanah dalam Pikovskaya cair
Mikrob terpilih diuji kemampuannya dalam melarutkan senyawa P sukar larut (Ca3(PO4)2) di medium pikovskaya cair. Mikrob yang akan diuji diremajakan terlebih dahulu kemudian diambil 1 ose mikrob tersebut diinokulasikan pada pikovskaya cair dan diinkubasi selama 5 hari. Kultur diinkubasi diatas shaker secara periodik. Pada akhir inkubasi kultur disentrifugasi dengan kecepatan 1048,12 x g selama 20 menit. Filtrat jernih yang diperoleh ditentukaan P larutnya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang (α) 660 nm
dan dibandingkan dengan kontrol.
A
B
IP :
Keterangan :
A : Lebar Zona bening B : Lebar Koloni Bakteri
A
B
Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase
Sebanyak 50 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu ruang di dalam medium Pikovskaya cair. Sebanyak 1 ml kultur, kemudian ditambahkan 1 ml Buffer fosfat, dan 1 ml 0.115 M p-nitro phenyl phosphate (p-NPP), kemudian diinkubasi selama 2 jam di dalam waterbath pada suhu 38ºC. Setelah diinkubasi selama 2 jam, ditambahkan 1 ml CaCl 0,5 M dan 4 ml 0.5 M NaOH kemudian dikocok dan disentrifuse. Larutan akan berubah menjadi warna kuning, hal ini menandakan bahwa bakteri menghasilkan enzim fosfatase. Semakin pekat warna kuning yang terbentuk, maka semakin tinggi enzim fosfatase yang dihasilkan. Kemudian dilakukan pengenceran 10x dengan mengambil 1 ml filtrat ditambahkan dengan 9 ml aquadest. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang (α) = 400 nm menggunakan Spectrophotometer.
g. Pengukuran Kurva Standar Bakteri
Kurva standar populasi mikrob terpilih ditentukan untuk menyamakan jumlah sel mikrob dalam percobaan selanjutnya. Kurva ini menyatakan hubungan antara nilai rapat optis suspensi mikrob dengan satuan pembentuk koloni (SPK) yang ditentukan dengan metode cawan hitung. Sehingga, inokulasi pada percobaan selanjutnya dapat menggunakan populasi mikrob yang seragam.
Isolat-isolat yang telah didapatkan diambil menggunakan ose kemudian ditumbuhkan pada media NB. Setelah 2 hari diinkubasi di atas shaker suspensi bakteri di dalam medium NB diencerkan berurut 2,3,4,8,dan 10 kali dan diukur nilai rapat optisnya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang (α) 620nm. Pada waktu yang bersamaan setiap tingkat pengenceran tersebut diatas, populasi mikrob ditentukan dengan metode hitungan cawan. Populasi mikrob dan nilai rapat optisnya dihubungkan dengan persamaan regresi linier, yang digunakan sebagai kurva baku populasi mikrob di dalam medium tersebut.
h.Uji Antagonis Empat Isolat Bakteri
Bakteri-bakteri yang digunakan untuk uji antagonis dapat dilihat pada Tabel 2. Satu koloni bakteri yang tumbuh terpisah di cawan petri, diambil menggunakan jarum ose dan digoreskan pada media NA yang telah disiapkan. Pengujian antagonis empat isolat bakteri tersebut dilakukan pada media agar (Gambar 5,6 dan 7). Pengamatan dilakukan setiap hari terhadap koloni bakteri dengan cara melihat pertumbuhan empat bakteri bersama-sama.
Gambar 6. Metode Uji Antagonis 3 isolat bakteri Isolat Bakteri 2 Isolat
Bakteri 1
Gambar 5. Metode Uji Antagonis 2 isolat bakteri
Cawan petri Isolat Bakteri 2 Isolat Bakteri 1 Isolat Bakteri 3 Cawan petri