III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.4.1 Penelitian tahap I :
Isolasi dan screening bakteri Pseudomonad fluorescens
Mengambil tanah disekitar perakaran (rizosfer) tanaman melon yang sehat diantara yang sakit beserta akarnya. Sampel tanah yang sudah diambil, kemudian dimasukkan kedalam kantong plastik untuk dibawa ke laboratorium.
Isolasi sampel tanah dilakukan di laboratorium dengan cara menimbang sampel tanah sebanyak 25 g, kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer yang berisi 250 ml aquadest steril. Mengkocok erlenmeyer tersebut selama ± 15 menit dengan menggunakan shaker, selanjutnya didiamkan selama 5 menit dan dilakukan seri pengenceran sampai 10-9, dengan cara mengambil 1 ml suspensi awal dengan menggunakan mikropipet, kemudian mencampurkan dengan 9 ml air steril kedalam tabung reaksi dan melakukan pengkocokan kembali. Seri pengenceran dilakukan
2 HSI (4) 8 HSI (2) 6 HSI (2) 8 HSI (4)
2 HSI (1) 2 HSI (3) 4 HSI (3) 8 HSI (1)
8 HSI (3) 6 HSI (1) 6 HSI (4) 2 HSI (2)
dengan cara yang sama sampai dengan 10-9, kemudian menumbuhkan suspensi tersebut pada media NA dan inkubasi bakteri selama 24 jam.
Mengambil koloni tunggal yang memperlihatkan karakter koloni yang transparan sampai buram, bercahaya, berlendir (mucoid) dengan bentuk cembung yang jelas (Schaad, 2001). Menumbuhkannya pada cawan petri yang berisi media NA dengan cara digores, selanjutnya menginkubasi bakteri lagi selama 24 jam pada suhu ruangan. Setelah mendapatkan isolat yang memperlihatkan karakter koloni bakteri, maka dilanjutkan dengan pengujian karakteristik Pseudomonad fluorescens
berdasarkan sifat gram, fluoresensi, dan pembusukan kentang (potato soft root) yaitu sebagai berikut :
a. Uji Gram
Membuat larutan KOH 3 % dengan cara melarutkan 0,3 g KOH kedalam 100 ml aquadest steril. Mengambil larutan KOH sebanyak 1 tetes kedalam gelas benda, setelah itu mengambil koloni tunggal dari media NA yang telah ditumbuhkan, kemudian menarik secara perlahan koloni tersebut yang telah dicelupkan pada larutan KOH 3 %. Pengamatan dilakukan terhadap adanya perubahan masa bakteri tersebut, yaitu perubahan masa bakteri menjadi berlendir dan tertarik ketika diangkat, perubahan masa tersebut menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat gram negatif (Fahy and Hayward, 1983).
b. Uji Fluoresensi
Mengambil koloni tunggal pada media NA dan menumbuhkannya pada
cawan petri yang berisi media King’s B. Menginkubasi bakteri selama 24 jam pada suhu ruangan, setelah itu mengamati bakteri di bawah sinar UV, jika koloni bakteri
tersebut berpendar dan berwarna hijau maka menghasilkan pigmen fluorescens
(Brown, 1980).
c. Uji Potato Soft Root
Memotong buah kentang berbentuk kotak, kemudian mencelupkan kentang tersebut ke dalam alkohol 70 %, lalu mencelupkan kembali ke dalam aquadest. Mengambil koloni tunggal bakteri pada media NA dan menggoreskannya pada bagian tengah kentang, setelah itu menaruh ke dalam cawan petri dan menginkubasi selama 24 jam. Pengamatan dilakukan terhadap adanya perubahan fisik kentang yang telah diinokulasi bakteri, berupa membusuk atau tidak membusuk (Schaad, 2001).
Isolasi jamur Fusarium sp.
Mengambil tanaman melon yang menunjukkan gejala layu pada daun bagian bawah yang menguning kecoklatan (Semangun, 2000); dan pada batang apabila dibelah, jaringan vaskular menunjukkan perubahan warna coklat (Varela dan Seif, 2004) beserta akarnya secara perlahan pada lahan melon di Desa Karang Sinom, Indramayu. Sampel tanaman yang sudah diambil, kemudian dimasukkan kedalam kantong plastik.
Melakukan isolasi sampel di laboratorium dengan cara membersihkan bagian batang tanaman yang sakit menggunakan alkohol 70 %. Mengering anginkan, kemudian memotong antara bagian kulit batang tanaman yang menunjukkan gejala nekrosis dan yang sehat menggunakan scalpel. Menginokulasi potongan tersebut pada media PDA. selanjutnya menginkubasi selama ± 5 hari (Sastrahidayat, 1994). Memurnikan jamur patogen yang memiliki ciri morfologi koloni seperti jamur
muda dan membentuk percabangan di dalam media (Semangun, 2004). Selanjutnya memperbanyak jamur Fusarium sp. pada media PDA.
Identifikasi jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis
Jamur Fusarium sp. yang sudah murni kemudian diidentifikasi berdasarkan morfologi koloni dan pengamatan mikroskopis. Identifikasi dilakukan terhadap warna, hifa, dan spora jamur tersebut. Hasil pengamatan morfologi jamur yang diperoleh dibandingkan dengan morfologi jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis
menggunakan buku taxonomi jamur Illustrated genera of imperfect fungi (Barnett dan Hunter, 1972).
Uji antagonistik bakteri Pseudomonad fluorescens terhadap jamur patogen Fusarium oxysporum f. sp. melonis secara in vitro
Pengujian antagonistik bakteri Pseudomonad fluorescens yang telah diisolasi dari rizosfer melon dilakukan terhadap Fusarium oxysporum f. sp. melonis di laboratorium. Uji antagonistik dilakukan dengan cara mensterilkan potongan kertas cakram berdiameter 0.5 cm ke dalam autoklaf. Mencelupkan potongan kertas cakram kedalam suspensi bakteri Pseudomonad fluorescens selama ± 10 menit, kemudian meletakkan kertas cakram tersebut pada cawan petri yang berisi media PDA. Pengambilan jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis dengan menggunakan
cork borer berdiameter 0.5 cm, dan meletakkan pada cawan petri yang sama dengan posisi kedua isolat berhadapan dengan jarak 3 cm di tengah cawan petri (Fokkema, 1976).
Menginkubasi selama 24 jam, selanjutnya melakukan pengamatan terhadap adanya zona bening diantara kedua mikroorganisme tersebut, dimana isolat yang
mempunyai persentase daya hambat tertinggi akan digunakan dalam penelitian tahap berikutnya.
3.4.2 Penelitian tahap II :
Inokulasi Pseudomonad fluorescens dan Fusarium oxysporum f. sp. melonis pada tanah pasir
Mensterilkan tanah pasir sebagai media tumbuh menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC dengan tekanan 15 pcs (per square inci) selama ± 20 menit, untuk bakteri Pseudomonad fluorescens umur 2 hari dilakukan seri pengenceran sampai 10-7, sedangkan untuk jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis umur 7 hari dilakukan seri pengenceran sampai 10-6, setelah itu melakukan inokulasi yang masing-masing menggunakan 10 ml per lubang tray (Olivain, Humber, Nahalkova, Fatehi, Horidon, dan Alobouvete, 2006).
Aplikasi Benih Melon pada Tanah Pasir
Mensterilkan benih melon dengan cara merendam benih ke dalam alkohol 95 % selama 10 detik, kemudian merendam benih kedalam H2O2 5 % dengan mengkocok selama ± 5 menit, selanjutnya membilas benih menggunakan aquadest steril sebanyak 7 kali.
Mensterilkan kertas cakram berdiameter 9 cm menggunakan autoklaf, kemudian membasahi kertas cakram menggunakan aquadest steril, selanjutnya menginokulasi benih pada kertas cakram. Menginkubasi benih selama 4 hari dalam keadaan gelap pada suhu ± 22 ºC. Benih yang telah berkecambah dengan ukuran 1 cm, ditanam pada tanah pasir yang telah diinokulasikan sesuai dengan perlakuan yang diteliti dan selanjutnya dilakukan pengamatan.
Pengamatan pola kolonisasi pada akar perkecambahan melon
Pengamatan dilakukan pada hari ke-1, ke-3, dan ke-5 setelah inokulasi dengan mencuci kecambah akar dari tanah yang menempel, selanjutnya melakukan perendaman dengan KOH selama 60 menit. Mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, untuk memudahkan pemotretan terhadap pola koloni
Fusarium oxysporum f. sp. melonis dengan menggunakan metode scanning dengan
lactovenol blue. Bagian akar yang telah diperlakukan tersebut diletakkan pada gelas benda cekung berisi media 0,1 % WA.
Melakukan pengamatan pola koloni Pseudomonad fluorescens dengan mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, melakukan perendaman dengan KOH selama 60 menit, kemudian kembali mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, untuk memudahkan pemotretan terhadap pola koloni
Pseudomonad fluorescens dengan menggunakan metode scanning dengan
methylene blue, selanjutnya meletakkan bagian akar pada gelas benda cekung
berisi media cair King’s B.
Pengamatan pola koloni Fusarium oxysporum f. sp. melonis dan
Pseudomonad fluorescens dilakukan dengan mencuci kecambah akar dari tanah yang menempel, selanjutnya melakukan perendaman dengan KOH selama 60 menit. Mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, selanjutnya akar kecambah dicelupkan kedalam lactovenol blue.selama 30 detik dan mencuci akar kecambah dengan aquadest steril, akar kecambah yang telah dicuci dicelupkan kedalam methylene blue selama 30 detik dan dicuci kembali dengan aquadest steril, selanjutnya meletakkan bagian akar pada gelas benda cekung dan mengamati masing-masing pola koloni sesuai dengan perlakuan menggunakan mikroskop.
Uji antibiosis bakteri Pseudomonad fluorescens dari rizosfer perkecambahan melon terhadap Fusarium oxysporum f. sp. melonis secara in vitro
Melakukan uji antibiosis dengan cara menimbang 1 g tanah yang
mengandung suspensi Pseudomonad fluorescens, kemudian dimasukkan ke dalam
10 ml aquadest steril, selanjutnya mengkocok selama 5 menit dan diendapkan selama ± 3 jam.
Mensentrifus suspensi tanah tersebut dengan kecepatan ± 200 rpm selama ± 20 menit, selanjutnya mengambil supenatan yang telah mengandung bahan antibiosis dan menyimpan dalam lemari es selama 24 jam. Mengambil jamur
Fusarium oxysporum f. sp. melonis dengan menggunakan cork borer berdiameter 0.5 cm, kemudian meletakkan pada cawan petri yang berisi media PDA.
Mensterilkan potongan kertas cakram berdiameter 0.5 cm, kemudian dicelupkan ke dalam larutan antibiosis Pseudomonad fluorescens selama 10 menit dan dikering anginkan, setelah itu meletakkan potongan kertas cakram pada cawan petri yang sama, dengan posisi kedua isolat berhadapan dengan jarak 3 cm di tengah cawan petri, selanjutnya melakukan inkubasi selama 24 jam.
3.5 Pengamatan
Pengamatan pada penelitian ini dilakukan secara destruktif dan parameter yang diamati pada penelitian ini adalah sebagai berikut :