Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan dari bulan Maret hingga Agustus 2008, bertempat di Instalasi Riset Lingkungan Perikanan Budidaya dan Toksikologi Cibalagung-Bogor. Analisis hematologi dan histopatologi di Laboratorium Kesehatan Ikan Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB.
Bahan dan Alat
Bahan yang dipergunakan selama penelitian adalah sebagai berikut:
a. Benih ikan mas yang berasal Desa Ciherang, dengan bobot 2,5-3,0 gram. b. Molusikisida Snaildown produksi Agricon dengan kandungan bahan aktif niklosamida 250 EC.
c. Pakan ikan, berupa pelet dengan kandungan protein 40 % (pakan stater udang). d. Aceton p.a sebagai pelarut dan KMnO4 (PK) 20 mg/l sebagai desifektan pada wadah pengujian sebelum penelitian dilaksanakan.
e. Bahan kimia untuk analisa kualitas air.
f. Bahan kimia untuk histopatologi dan hematologi. g. Penyiapan larutan uji dengan membuat larutan induk Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu:
a. Wadah pengujian berupa akuarium kaca yang terdiri dari: 21 unit ukuran 40 x 20 x 20 cm (uji toksisitas akut) dan 16 unit berukuran 70 x 50 x 60 cm (uji toksisitas
b. Blower yang digunakan utuk airasi media uji.
c. Peralatan untuk pembuatan berbagai konsentrasi perlakuan, yaitu: gelas ukur, pipet, labu ukur dan bulp.
d. Peralatan untuk perhitungan dan pengamatan parameter darah, yaitu: jarum suntik, tabung dan sentrifius mikrohematokrit, skala hematokrit, hemositometer, pipet, gelas objek dan penutup, serta mikroskop.
e. Peralatan untuk histopatologi, yaitu: peralatan bedah, botol contoh, larutan fiksasi (Bouins), larutan pencuci (NaCl fisiologis),.
f. Timbangan digital dengan ketelitian 0,01 gram.
g. Peralatan untuk pengukuran kualitas air, yaitu: termometer, pH meter, DO meter,spektrofotometer.
Pelaksanaan Penelitian Ambang Batas
Uji ambang batas bertujuan untuk menentukan kisaran letal ambang atas (LC10024 jam) dan konsentrasi letal ambang bawah (LC0-48 jam) (Busvine, 1971). Nilai ambang batas daya racun letal moluskisida terhadap ikan mas dengan deret konsentrasi uji: 0,00; 0,06; 0,10; 0,20; 0,25mg/L. Penghitungan konsentrasi larutan uji ditentukan dengan mengacu pada persamaan berikut:
V1.N1 = V2.N2 ………. (1)
Keterangan:
N1 = konsentrasi niklosamida dalam larutan stok
N2 = konsentrasi niklosamida yang diinginkan dalam media air
V1 = volume larutan stok yang akan dimbil
V2 = volume media air penelitian yang diinginkan
Waktu letal
Pengujian waktu letal bertujuan untuk mengetahui tingkat peluruhan konsentrasi moluskisida niklosamida dalam air berdasarkan pada kematian ikan. Prosentase penurunan kematian ikan akan dijadikan acuan untuk menentukan presentase dan interval waktu pergantian air bagi kestabilan konsentrasi perlakuan
pada tahap pengujian selanjutnya. Konsentrasi moluskisida niklosamida dianggap tidak stabil apabila kematian ikan mencapai 80% yang didentik dengan penurunan konsentrasi bahan kimia tersebut mencapai ≤ 20% dari kondisi awal (Koesoemadinata, 2003).
Pengujian dilakukan dengan mengaplikasikan tingkat konsentrasi nilai LC100- 24 jam dengan 3 kali ulangan untuk waktu pengamatan 0; 12; 24; 36; 48 jam. Penentuan konsentrasi larutan uji ditentukan dengan mengacu pada persamaan 1. Larutan niklosamida 0,25 mg/L disebar merata pada permukan air untuk ke empat wadah kemudian diaduk dengan pengaduk kaca, selanjutnya dimasukkan ikan pada waktu 0 jam, 12 jam, 24 jam, 36 jam. Pengamatan dilakukan setiap 12 jam. Selama uji stabilitas tidak dilakukan pergantian air
Toksisitas akut
Pengujian toksisitas akut untuk mencari nilai LC50 dari moluskisida niklosamida terhadap ikan mas yang ditentukan dengan metode uji hayati (bioassay) (Busvine, 1971), untuk menentukan Median Lethal Concentration (LC50) yang besarnya berada antara nilai ambang atas dan ambang bawah yang dapat ditentukan dengan persamaan 2 dan 3 dengan deretan konsentrasi: 0.00; 0,08; 0,10; 0,12; 0,14; 0,17; 0,20 mg/L.
Log (N/n) = k log (a/n) ……… (2)
a/n=b/a=c/b=d/c=e/d=f/e ……… (3)
Keterangan:
N = konsentrasi ambang atas n = konsentrasi ambang bawah K = Jumlah konsentrasi yang diuji (6)
a, b, c, d, e, f adalah konsentrasi yang diuji dengan nilai a sebagai konsentrasi terkecil
Konsentrasi bahan uji tidak diverifikasi secara analisis kimia dan nilai LC50 ditentukan berdasarkan konsentrasi nominal moluskisida niklosamida dalam wadah-
akuarium kaca yang berukuran 40 x 20 x 20 cm. Masing- masing akuarium dilengkapi saluran pemasukan dan pengeluaran serta penampungan air pengganti. Banyaknya ikan uji setiap wadah 10 ekor dengan waktu pemaparan selama 24, 48, 72, dan 96 jam dengan peubah yang diukur adalah mortalitas ikan.
Toksisistas Subletal Niklosamida TerhadapPertumbuhan
Pengujian dilakukan dengan metode uji hayati penggantian media uji (renewal test), yaitu melakukan pergantian air pemeliharaan setiap 48 jam dengan konsentrasi niklosamida yang sama untuk masing-masing perlakuan. Sebagai perlakuan digunakan 4 konsentrasi, yaitu 0, 10, 30, dan 50 % dari nilai LC50 96 jam, masing- masing perlakuan diulang 4 kali. Wadah yang digunakan berupa 16 unit akuarium kaca yang berukuran. 70 x 50 x 60 cm. Jumlah ikan yang diuji sebanyak 20 ekor/wadah dengan waktu pemaparan 12 minggu. Pengukuran untuk pertumbuhan adalah bobot ikan yang dilakukan minggu ke 4, 8, dan 12 untuk setiap perlakuan.
Selama penelitian ikan uji diberi pakan secara at satiation menggunakan pakan pelet komersial dengan kandungan protein 40 %. Pengukuran parameter fisika kimia air dilakukan sebelum dan sesudah ganti konsentrasi media pemeliharaan yaitu: suhu air, pH, 02 terlarut, CO dan amonia.
Toksisitas Subletal Niklosamida Terhadap Hematologi
Ikan mas yang telah dipaparkan dalam setiap perlakuan pada pengujian subletal niklosamida terhadap pertumbuhan, yang dilakukan pada 1 jam pertama (minggu ke 0), minggu ke 4, minggu ke 8, dan minggu ke 12, masing-masing diambil satu ekor untuk satu akuarium (unit penelitian). Pengambilan darah dilakukan dengan menggunakan jarum suntik steril pada bagian vena caudalis ikan uji. Jarum suntik tersebut sebelum digunakan terlebih dahulu dibasahi dengan Na-Sitrat 3,8% yang berfungsi sebagai antikoagulan. Sampel darah diambil untuk pengukuran parameter hematologis, yaitu kadar hematokrit, kadar hemoglobin, eritrosit dan jumlah leukosit.
Kadarhematokrit diukur dengan metode Anderson dan Siwicki (1993).Darah dihisap dengan menggunakan tabung mikrohematokrit berlapis heparin yang berfungsi mencegah pembekuan darah dalam tabung, sampai volume darah mencapai ¾ bagian tabung kemudian salah satu ujung tabung disumbat dengan critosea untuk selanjutnya disentrifius dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Pengukuran kadar hematokrit dilakukan dengan membandingkan volume benda darah terhadap volume seluruh darah dengan menggunakan skala hematokrit dan dinyatakan dalam persentase hematokrit (%Ht).
Kadar Hemoglobin
Kadar hemoglobin diukur menurut metoda Sahli dengan Sahlinometer (Wedemeyer dan Yasutake, 1977). Darah dihisap menggunakan pipet Sahli hingga mencapai skala 20 m 3, kemudian dipindahkan kedalam tabung Hb yang berisi HCl 0,1 N sampai skala 10 (kuning). Kemudian tunggu selama 3-5 menit agar Hb bereaksi dengan HCl membentuk asam hemarin, kemudian aduk dan tambahkan akuades hingga warnanya sama dengan standar. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat tinggi permukaaan larutan yang dikocok dengan skala lajur g% yang menunjukkan banyaknya Hb dalam gram setiap 100 ml darah dan dinyatakan dalam persentase (%Hb).
Jumlah Eritrosit
Jumlah eritrosit dihitung menurut metoda Blaxhall dan Daisley (1973).Sampel darah diencerkan dengan larutan Hayem untuk menghancurkan sel darah putih agar jumlah sel darah merah dapat dihitung. Pengenceran dilakukan dengan menggunakan pipet pencampur berskala maksimum 11 yang dilengkapi pengaduk.
Darah dihisap dengan pipet hingga skala 1, kemudian dihisap larutan Hayem hingga skala 11 menggunakan pipet yang sama. Pipet digoyang selama 15 menit agar darah tercampur secara merata, sedangkan larutan pada ujung pipet yang tidak tercampur segera dibuang. Darah yang teraduk diteteskan kedalam hemositometer
yang dilengkapi gelas penutup hingga memenuhi seluruh permukaan yang berskala, selanjutnya dilakukan penghitungan dibawah mikroskop.
Jumlah Leukosit
Jumlah leukosit dihitungdengan metoda Blaxhall dan Daisley (1973). Sampel darah diencerkan dengan larutan Turks untuk menghancurkan sel darah merah agar jumlah sel darah putih dapat dihitung. Untuk mengencerkan leukosit digunakan pipet berskala maksimal 11 yang dilengkapi pengaduk. Mula-mula darah dihisap hingga skala 1, kemudian dilanjutkan dengan menghisap larutan Turks hingga skala 11. Pencampuran dilakukan dengan mengaduk pipet selam 15 menit agar darah tercampur secara merata. Setelah pencampuran selesai, teteskan kedalam hemositometer yang dilengkapi gelas penutup hingga memenuhi seluruh permukaan yang berskala, selanjutnya dilakukan penghitungan leukosit dibawah mikroskop.
Toksisitas Subletal Niklosamida Terhadap Histopatologi
Ikan mas yang telah dipaparkan dalam setiap perlakuan pada uji subletal terhadap pertumbuhan, masing-masing diambil satu ekor per unit penelitian untuk sampel organ dalamnya, yaitu: insang, hati dan ginjal untuk pengamatan histopatologis, yang dilakukan pada minggu ke-4, minggu ke-8, dan minggu ke-12.
Pembuatan Preparat Histopatologi Fiksasi jaringan dan Parafinisasi
a. Fiksasi : untuk mencegah pembusukan jaringan, maka jaringan yang telah diambil kemudian direndam dalam larutan fiksatif selama 3 x 24 jam. Larutan fiksatif yang digunakan ialah larutan Bouins.
b. Dehidrasi : mengeluarkan cairan dari dalam sel dengan cara merendam dalam bahan kimia dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi.
Pertama-tama jaringan yang dipilih direndam Alkohol 70 % selama 2 beberapa hari, kemudian dilanjutkan direndam berturut-turut dengan alkohol
c. Clearing : mengeluarkan alkohol dan memasukkan xylol (parafin larut dalam xylol ; tidak larut dalam alkohol)
Setelah didehidrasi jaringan tersebut direndam Alkohol xylol (1:1) ½ jam, dilanjutkan dengan xylol 3 kali masing-masing ½ jam.
d. Impregnasi ; penggantian xylol dengan paraffin
Cara direndam dalam parafin dengan titik cair 58-60oC;dalam oven yang dipanaskan pada 65-70oC, Xylol paraffin (1:1) ¾ jam.
e. Embedding : memasukan paraffin ke dalam sel
Jaringan tersebut direndam dengan parafin 3 kali masing-masing ¾ jam.
f. Blocking : mencetak jaringan sehingga mudah untuk dipotong
Pemotongan jaringan
Dilakukan dengan mikrotom, ketebalan sayatan 4 mikrometer ;untuk jaringan lunak setelah dipotong dimasukan ke air suam-suam kuku (+ 400C) sehingga pita potongan jaringan mengapung dan bisa dipotong untuk selanjutnya ditata dalam gelas objek.
Pewarnaan jaringan
a. Hidrasi : mengeluarkan paraffin
Direndam dengan Xylol sebanyak 2 kali masing-masing 3 menit, lalu alkohol 100 % sebanyak 2 kali masing-masing 3 menit, dilanjutkan dengan alkohol 95%, 90%, 80%, 70%, 50% masing-masing 3 menit dan kemudian dicuci dengan akuades 2 kali
b. Pewarnaan H-E
Direndam dengan Hematoksilin 7 menit, dicuci dengan air 7 menit, dilanjutkan dengan Eosin 3 menit dan dicuci dengan akuades.
c. Dehidrasi: mengeluarkan air
Direndam dengan alkohol 50 % sebanyak 2 kali masing-masing 2 menit, dilanjutkan dengan alkohol 70 %, 85 %, 90 %, 100 % masing-masing 2 menit
Lalu ditutup dengan gelas penutup yang sudah di tetesi dengan entelan, dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC selama 24 jam.
Selanjutnya dilakukan pengamatan preparat histologis dengan mikroskop dan dianalisa secara deskriptif.
Analisis Data
Data komulatif mortalitas ikan mas pada pengujian definitif menggunakan analisis probit (Wallace, 1982) dengan bantuan program “probit analysis” untuk menentukan nilai LC 50 pada waktu pemaparan 24, 48, 72, dan 96 jam, sedangkan untuk analis data sifat fisika-kimia air (suhu, pH, oksigen terlarut, karbondioksida, amoniak) dilakukan secara deskriptif untuk mengetahui kelayaknya sebagai media uji.
Pertumbuhan individu ikan mas selama waktu pemaparan dalam uji toksisitas subletal dihitung berdasarkan model laju pertumbuhan harian individu menurut rumus Ricker (1975):
SGR = (lnWt –ln Wo)/∆t x 100% ……….(4)
Keterangan:
SGR = laju pertumbuhan harian individu (%)
Wt = bobot rata-rata individu pada akhir pengamatan (g) Wo = bobot rata-rata individu pada awal pengamatan (g)
∆t = waktu pemaparan
Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap (RAL), analisa data untuk pengaruh perlakuan terhadap pertumbuhan dan hematologi menggunakan analisis varian (anova) yang dilanjutkan dengan uji Tukey apabila berbeda nyata (Steel dan Torrie, 1989). Pengolahan data menggunakan program SPSS versi 13. Pengaruh perlakuan terhadap histopatologi ikan mas dilakukan secara deskiptif.