Penelitian utama, fermentasi dilakukan dengan mengkombinasikan perlakuan konsentrasi substrat dan laju aerasi yang diberikan. Pada cairan fermentasi dialirkan udara dengan laju 1vvm dan 2vvm secara terus menerus (aerasi penuh) pada keempat konsentrasi substrat yang berbeda yaitu 18%, 24%, 30%, dan 36%. Aerasi diberikan dengan cara mengalirkan udara secara langsung (air bubble). Menurut Johnson (2008), aerasi dengan cara air bubble cukup efektif untuk meningkatkan kadar oksigen terlarut dalam cairan fermentasi. Saccharomycess sp. bersifat fakultatif aerobik, dimana pada kondisi aerobik, oksigen berperan sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetiknya. Menurut Meyer (1978), pada kondisi aerobik pemanfaatan gula menghasilkan penambahan biomassa sel dengan reaksi :
C6H12O6 CO2 + H2O + Biomassa sel
Dengan pemberian aerasi diharapkan terjadi perbanyakan sel Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus secara maksimal. Pada kondisi aerob gula akan dikonversi menjadi energi melalui siklus Krebs, energi ini diperlukan sel untuk memperbanyak diri.
1. Biomassa
Biomassa yang dihitung adalah bobot biomassa kering yang terdapat dalam cairan fermentasi. Selama fermentasi khamir mengalami pertumbuhan
20 yang ditandai dengan semakin bertambahnya jumlah biomassa dari waktu ke waktu. Khamir tumbuh dalam media sederhana yang mengandung karbohidrat yang dapat terfermentasi sebagai sumber energi dan biosintesis, nitrogen yang cukup untuk sintesis protein, dan garam mineral serta faktor pertumbuhan (Campbell, 1999 di dalam Priest dan Campbell, 1999). Hasil pengamatan pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus dapat dilihat pada Gambar 5 dan Gambar 6.
Gambar 5. Kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus pada laju aerasi 1 vvm
Gambar 6. Kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus pada laju aerasi 2 vvm
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 0 6 12 18 24 ln [B iom as sa ] Waktu (Jam) 18% 24% 30% 36% -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 0 6 12 18 24 ln [B iom as sa ] Waktu (Jam) 18% 24% 30% 36%
21 Dari data tersebut dapat diketahui bahwa sumber karbon berupa dekstrin ternyata dapat dimanfaatkan oleh Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus untuk memperbanyak diri dalam jumlah yang cukup, untuk kemudian menghasilkan etanol. Dekstrin terlebih dahulu akan dipecah menjadi glukosa agar dapat dimetabolisme di dalam sel. Pada konsentrasi substrat 18%-30% laju pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi dekstrin yang digunakan. Namun pada konsentrasi yang lebih tinggi dari 30% laju pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus menurun. Menurut Wang et. al (1979) konsentrasi substrat yang tinggi dapat menyebabkan terjadinya inhibisi substrat serta glucose effect yang dapat menghambat pertumbuhan. Menurut Reed dan Rehm (1983) Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus dapat memfermentasi glukosa, maltosa, sukrosa, dan rafinosa. Pertumbuhan khamir dalam disakarida, oligosakarida, dan polisakarida memerlukan sistem enzim untuk metabolisme berupa eksoenzim dan enzim lainnya. Enzim-enzim ini memerlukan waktu induksi selama pertumbuhan (Griffin, 1981).
Dengan pemberian aerasi pada laju 2 vvm ternyata justru menekan pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus. Hal ini disebabkan oleh berlebihnya suplai O2 yang diberikan melebihi kebutuhan yang
seharusnya, sehingga meningkatkan stress (tekanan) bagi Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus itu sendiri. Pemberian aerasi dengan laju yang tinggi mengakibatkan terbentuknya busa pada permukaan media. Adanya busa dapat menyebabkan khamir terbawa ke permukaan, sehingga mengalami lisis dan mati.
Berdasarkan data pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus pada Gambar 5 dan Gambar 6, maka dipilih perlakuan dengan laju aerasi 1vvm dan konsentrasi substrat 30% sebagai perlakuan terbaik. Perlakuan dengan laju aerasi 1vvm dan konsentrasi substrat 30% digunakan pada penelitian utama, karena menghasilkan biomassa paling banyak serta menghasilkan laju pertumbuhan yang terbaik.
22 2. pH
Nilai pH pada awal fermentasi diset 5. Menurut Harrison dan Graham (1970), pH optimum untuk fermentasi yaitu 4,5-5,0. pH diatur dengan penambahan larutan HCl 3% pada media. Hasil pengukuran pH selama proses fermentasi dapat dilihat pada Gambar 7 dan Gambar 8.
Gambar 7. Kurva perubahan pH pada fermentasidengan laju aerasi 1 vvm
Gambar 8. Kurva perubahan pH pada fermentasidengan laju aerasi 2 vvm
Selama fermentasi terjadi penurunan pH. Pada 6 jam pertama fermentasi terjadi penurunan pH yang cukup drastis. Penurunan pH yang terjadi selama proses fermentasi dikarenakan adanya akumulasi H+ selama proses konsumsi substrat oleh Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus.
0 1 2 3 4 5 6 0 6 12 18 24 pH Waktu (Jam) 18% 24% 30% 36% 0 1 2 3 4 5 6 0 6 12 18 24 pH Waktu (Jam) 18% 24% 30% 36%
23 Sumber N pada media tersedia dalam bentuk NH4+, sedangkan khamir
mengkonsumsi sumber N dalam bentuk NH3. Sehingga selama metabolisme
berlangsung khamir meninggalkan H+ dalam media (Fardiaz, 1988). Penurunan nilai pH juga dapat disebabkan karena terjadinya akumulasi produk samping berupa asam piruvat, asam sitrat, dan asam oksaloasetat yang dihasilkan selama metabolisme melalui EMP pathway.
3. Konsumsi Substrat
Gambar 9 memperlihatkan data hasil pengukuran total gula pada berbagai konsentrasi substrat selama fermentasi berlangsung.
Gambar 9. Kurva konsumsi substrat pada fermentasi dengan laju aerasi 1 vvm
Pada semua konsentrasi yang diuji terjadi penurunan nilai total gula selama fermentasi. Hal ini menunjukkan bahwa substrat yang diberikan dalam hal ini dekstrin dapat dikonsumsi oleh Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus. Pada keempat konsentrasi tersebut Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus langsung dapat menyesuaikan dengan keadaan yang ada, sehingga langsung dapat mengkonsumsi gula dalam substrat. Hal ini ditandai dengan terjadinya penurunan konsentrasi gula secara drastis pada awal masa fermentasi. Menurut Young (1996) dalam Priest dan Campbell (1999), glukosa cepat dikonsumsi oleh khamir pada tahap awal fermentasi.
Semakin rendah konsentrasi total gula maka kemampuan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus mengkonsumsi substrat juga
0 50 100 150 200 250 300 350 400 -6 0 6 12 18 24 T ot al G ul a (g/ l) Waktu (Jam) 18% 24% 30% 36% B
24 semakin rendah. Hal ini disebabkan pada konsentrasi rendah jumlah gula sederhana yang tersedia sangat sedikit. Gula sederhana seperti glukosa dan frukosa sangat penting bagi Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus pada masa awal pertumbuhannya. Namun jika konsentrasi substrat yang diberikan terlalu tinggi, maka akan diperlukan waktu fermentasi yang lebih lama, serta semakin banyak sisa gula yang tidak termanfaatkan. Moat (1979) menyatakan bahwa pada konsentrasi substrat yang tinggi sel khamir akan mengalami plasmolisis (hancurnya lapisan pelindung terluar pada sel). Dengan terjadinya plasmolisis aktivitas fermentasi terhambat bahkan dapat menyebabkan kematian pada sel khamir.
Disakarida, sukrosa, dan maltosa dapat difermentasi oleh khamir selama khamir tersebut menghasilkan enzim sukrase (invertase) dan maltase yang mengkonversi gula agar mudah terfermentasi (Stark dalam Underkofler dan Hickey, 1954). Disakarida seperti sukrosa dan maltosa dapat difermentasi oleh khamir pembuat bir. Menurut Wang et al. (1979), jika mikroorganisme hidup pada lingkungan yang mengandung polimer seperti pati ditambah amonium dan garam mineral, maka pertama kali pati akan dirubah menjadi glukosa, kemudian glukosa digunakan sebagai penyedia energi dan produk antara. Mikroorganisme juga akan memproduksi enzim untuk mengurai substrat jika pada substrat yang digunakan terdapat beberapa jenis karbon.
Gambar 10. Histogram efisiensi pemanfaatan substrat pada fermentasidengan laju aerasi 1 vvm 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 18 24 30 36 E fi si ens i pe m anf aa ta n s ubs tr at ( % )
25 Efisiensi pemanfaatan substrat yang ditampilkan pada Gambar 10 nampak sejalan dengan pertumbuhan biomassa (Gambar 5) serta jumlah etanol yang dihasilkan (Gambar 11). Secara umum nilai efisiensi pemanfaatan substrat sirup dekstrin oleh Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus masih rendah. Hal ini disebabkan karena gula yang terkandung dalam dekstrin masih berupa oligosakarida dan disakarida yang sukar dimetabolisme oleh khamir secara langsung.
4. Kadar etanol
Fermentasi etanol merupakan sebuah proses biologis dimana gula seperti glukosa, fruktosa, dan sukrosa diubah menjadi energi seluler serta produk sisa metabolisme berupa etanol dan karbon dioksida. Hasil pengukuran kadar etanol yang dihasilkan pada penelitian pertama ditampilkan pada Gambar 11.
Gambar 11. Histogram kadar etanol penelitian pertama
Kadar etanol pada fermentasi dengan laju aerasi 1vvm menunjukkan kecenderungan naik seiring dengan naiknya konsentrasi dekstrin yang digunakan. Pada fermentasi dengan laju aerasi 2vvm peningkatan konsentrasi substrat tidak terlalu berpengaruh terhadap peningkatan jumlah etanol yang dihasilkan. Dari data diatas juga dapat diketahui bahwa pemberian aerasi
0 5 10 15 20 25 18% 24% 30% 36% E ta nol ( g/ l) Total Gula (%b/v) 1 vvm 2 vvm
26 yang lebih besar dari 1vvm tidak memberikan pengaruh terhadap peningkatan jumlah etanol yang dihasilkan. Hal ini dapat disebabkan pada fermentasi dengan laju aerasi 2vvm kandungan oksigen dalam cairan fermentasi sangat tinggi, sehingga mengurangi kemampuan khamir untuk mengkonversi substrat menjadi etanol. Khamir dapat melakukan fermentasi yang merubah gula menjadi etanol pada kondisi lingkungan yang aerob, namun belum maksimal. Namun begitu hal ini membuktikan bahwa dekstrin dapat digunakan sebagai alternatif sumber karbon pada pembuatan etanol.
5. Kinetika Fermentasi
Sistem fermentasi yang digunakan pada penelitian ini adalah sistem batch (tertutup). Kinetika fermentasi pada sistem batch dapat menggambarkan pertumbuhan khamir dan pembentukan produk dari khamir. Parameter kinetika fermentasi yang dihitung diantaranya laju pertumbuhan biomassa, rendemen substrat menjadi biomassa (Yx/s), rendemen substrat menjadi produk (Yp/s), dan rendemen produk terhadap jumlah biomassa (Yp/x).
Tabel 2. Nilai laju pertumbuhan spesifik maksimum (μmaks) pada fermentasi
dengan laju aerasi 1vvm
Konsentrasi Total Gula 18% 24% 30% 36%
μmaks (jam-1) 0,18 0,21 0,29 0,23
Dari data pada Tabel 2 diketahui bahwa nilai μmaks paling tinggi
dihasilkan pada perlakuan fermentasi dengan konsentrasi total gula 30% dan telah dicapai pada jam ke-6. Hal ini sesuai dengan data pertumbuhan biomassa, yang pada jam ke-6 telah berada pada akhir fase eksponensial. Laju pertumbuhan spesifik dipengaruhi oleh ketersediaan nutrien serta kondisi lingkungan hidup mikroorganisme seperti suhu, pH, dan ketersediaan oksigen. Kecepatan pertumbuhan mempengaruhi ukuran sel dan jumlah asam nukleat (Fardiaz, 1988). Pada penelitian utama akan dilakukan penghentian aerasi yang dilakukan pada saat nilai μmaks telah tercapai atau saat
27 pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus berada pada fase logaritmik, yaitu pada jam ke-6.
Tabel 3. Rendemen (b/b) hasil fermentasi dengan laju aerasi 1vvm 18% 24% 30% 36%
Yp/s 0,49 0,49 0,33 0,38 Yx/s 0,11 0,08 0,07 0,06 Yp/x 4,29 6,00 4,64 6,55
Δ s/s 0,12 0,17 0,18 0,14
Dari data pada Tabel 3 diketahui bahwa nilai rendemen produk per substrat (Yp/s) pada fermentasi dengan konsentrasi gula rendah lebih tinggi dibandingkan nilai rendemen pada substrat dengan konsentrasi gula yang lebih tinggi, sedangkan untuk nilai rendemen biomassa per substrat (Yx/s) semakin menurun seiring meningkatnya konsentrasi total gula pada substrat.