Ganyong 1 Ganyong 2 Singkong 1 Uwi 3 Talas
A. PENELITIAN PENDAHULUAN
2. Penentuan Konsentrasi Gula Terbaik untuk Substrat
Pembuatan sirup glukosa dari pati menggunakan metode hidrolisis enzim. Menurut Tjokroadikoesoemo (1986), pembuatan sirup glukosa dengan cara hidrolisis enzim menghasilkan rendemen yang lebih tinggi dan mutu yang lebih baik dibandingkan dengan hidrolisis asam.
Tahap pembuatan sirup glukosa dari pati meliputi likuifikasi dan sakarifikasi. Proses lebih jelasnya dapat dilihat pada lampiran 3. Enzim yang digunakan pada tahap likuifikasi adalah enzim α-amilase (Thermamyl, NOVO), sedangkan untuk proses sakarifikasi menggunakan enzim amiloglukosidase. Dosis enzim yang digunakan mengacu pada penelitian Budiyanto, dkk. (2006), yaitu untuk enzim α-amilase adalah 1 ml/kg pati kering, sedangkan untuk enzim amiloglukosidase adalah sebanyak 1,2 ml/kg pati kering. Waktu untuk proses likuifikasi adalah 60 menit dengan suhu 950C. Sedangkan proses sakarifikasi memakan waktu 60 jam dengan suhu 600C. Sirup glukosa yang dihasilkan akan digunakan sebagai sumber karbon pada media kultivasi untuk fermentasi.
Penelitian tahap ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi gula terbaik pada substrat yang akan digunakan pada proses fermentasi utama. Konsentrasi gula yang dibandingkan adalah 18, 24, 30 dan 36 % (b/v). Parameter yang digunakan untuk memilih konsentrasi gula terbaik yaitu banyaknya total biomassa yang ada dalam kondisi tersebut. Banyaknya total biomassa yang tumbuh diharapkan akan sejalan dengan banyaknya etanol yang dihasilkan.
Schisaccharomycces pombe merupakan khamir yang bersifat fermentatif fakultatif serta tahan terhadap kadar gula tinggi (Deak et. al., 1996). Khamir tumbuh baik pada kondisi aerobik, walaupun demikian beberapa khamir dapat tumbuh pada kondisi anaerobik. Proses respirasi pada kondisi aerobik selanjutnya digantikan proses fermentasi pada kondisi anaerobik karena tidak tersedia lagi oksigen (Barnett et. al, 2000).
Paturau (1981) menyatakan bahwa fermentasi etanol memakan waktu 30-72 jam. Etanol merupakan produk metabolit primer. Metabolit primer
Perbandingan Bobot Sel Kering (g/L) 0 1 2 3 4 5 6 7 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Jam ke S e l 18% 24% 30% 36%
diproduksi selama fase pertumbuhan keseluruhan (Riadi, 2007). Menurut Frazier dan Westhoff (1978), suhu optimum fermentasi 25-30 0C.
Fermentasi dilakukan selama 48 jam pada suhu ruang. Untuk menghomogenkan oksigen dan sel mikroba, media diberi perlakuan agitasi dengan kecepatan 150 rpm. Oksigen sangat diperlukan khamir untuk memperbanyak biomassanya. Konsentrasi gula yang menghasilkan total biomassa paling tinggi pada fermentasi pendahuluan ini akan dijadikan acuan pada penelitian utama. Analisis total biomassa yang digunakan adalah dengan menghitung total biomassa kering. Sebelumnya terlebih dahulu dibuat kurva standar yang menghubungkan antara nilai OD (Optical Density) dengan bobot biomassa kering (gram/ml). Kurva standar dari bobot biomassa kering dapat dilihat pada lampiran 5.
Kandungan total biomassa kering dalam substrat dapat diketahui dari pengukuran nilai OD pada Spectrofotometer Hach. OD diukur dan dimasukkan dalam kurva standar, kemudian akan diperoleh total biomassa kering dalam gram/ml. Bobot biomassa kering yang diukur tiap 6 jam kemudian dibentuk grafik pertumbuhan khamir seperti pada gambar 6.
Gambar 6. Grafik pertumbuhan biomassa pada masing-masing konsentrasi gula
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pertumbuhan khamir yang paling tinggi terdapat pada substrat dengan konsentrasi gula 36 % (b/v). Schisaccharomycces pombe lebih mampu bertahan terhadap kadar gula yang tinggi dibandingkan dengan khamir Saccharomyces cerevisiae. Berdasarkan
penelitian Haryani (2008), sirup glukosa dengan kadar gula 24 % (b/v) adalah yang paling optimum untuk pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae. Terdapat kemungkinan khamir Schisaccharomycces pombe masih dapat tumbuh pada konsentrasi yang lebih tinggi dari 36 % (b/v). Menurut Barnett et. al., (2000), Schisaccharomycces pombe termasuk khamir osmofilik, yaitu memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media dengan aw kurang dari 0,85 setara dengan kadar glukosa 60% b/b. Dengan kemampuan Schisaccharomycces pombe untuk hidup pada substrat dengan kadar gula tinggi, diharapkan menghasilkan etanol yang lebih tinggi pula. Karena itu pada penelitian utama digunakan substrat dengan kadar gula 36 % (b/v) untuk memaksimalkan rendemen etanol.
Dari grafik pada gambar 6 diatas dapat dilihat bahwa fase eksponensial berlangsung pada jam ke 0 sampai 12. Setelah itu digantikan oleh fase perlambatan pada jam ke 12 sampai 24. Fase stasioner berlangsung pada jam ke 24 sampai 48. Pola pertumbuhan mikroba diatas sesuai dengan yang dinyatakan oleh Stanbury dan Whitaker (1984), bahwa pola pertumbuhan mikroba dalam kondisi batch adalah sebagai berikut :
Laju Pertumbuhan Spesifik (per jam) -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Jam ke µ µ (/jam)
Laju pertumbuhan spesifik (µ) dari khamir pada substrat dengan konsentrasi gula 36 % (b/v) digambarkan dalam grafik sebagai berikut :
Gambar 8. Laju Pertumbuhan Spesifik (µ) Schisaccharomycces pombe pada substrat dengan konsentrasi 36 % (b/v)
Pada grafik diatas dapat dilihat bahwa µ mengalami peningkatan hingga jam ke-6, setelah itu turun hingga jam terakhir fermentasi. Ketika khamir berada dalam fase eksponensial µ mengalami peningkatan tajam hingga mencapai titik maksimal, yang disebut dengan µmax. Pada fermentasi
tahap ini, µmax dari Schisaccharomycces pombe terjadi pada jam ke-6.
Setelah khamir melewati fase eksponensial, maka pertumbuhan menjadi lambat sehingga µmax turun. µmax akan terus menurun hingga pertumbuhan
terhenti. Pertumbuhan khamir terhenti ketika khamir mengalami fase stasioner, yang mana pada waktu itu µ tetap. Setelah itu khamir mengalami fase kematian. Grafik pada gambar 8 sesuai dengan grafik laju pertumbuhan spesifik (µ) pada kultur curah seperti yang disitir oleh Mangunwidjaja dan Suryani (1994) pada gambar 9 berikut ini :
Selain total biomassa, dilakukan juga analisis pendukung terhadap hasil fermentasi yang meliputi kadar etanol, total gula sisa dan pH. Selain itu dilakukan juga perhitungan terhadap µmaks, Yx/s, Yp/s dan Yp/x.. Hasil dari
analisis dan penghitungan tersebut dapat dilihat pada tabel 5. Tabel 5. Hasil analisis pendukung pada fermentasi pendahuluan
Parameter Pengukuran
Konsentrasi Sirup Glukosa 18 % (b/v) 24 % (b/v) 30 % (b/v) 36 % (b/v) Biomassa yang tumbuh
(g/L) 3,012 3,881 4,761 5,100
Konsumsi Gula (g/L) 37,013 72,727 82,468 81,169 Total Gula Sisa (g/L) 128,5 164,2 208,4 263,6 Rendemen Etanol (g/L) 9,059 8,182 16,904 17,538
µmaks (jam-1) 0,129 0,130 0,134 0,129
Yx/s 0,081 0,053 0,058 0,063
Yp/s 0,245 0,113 0,205 0,216
Yp/x 3,008 2,109 3,550 3,439
Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa kadar etanol paling tinggi dihasilkan dari substrat dengan konsentrasi gula awal 36 % (b/v). Jumlah biomassa yang tumbuh paling banyak dihasilkan dari substrat dengan konsentrasi gula awal 36 % (b/v) serta menghasilkan nilai µmaks 0,129 jam-1.
Substrat dengan konsentrasi gula awal 18 % (b/v) memiliki efisiensi substrat terhadap rendemen biomassa (Yx/s) paling besar. Efisiensi substrat terhadap rendemen etanol (Yp/s) paling besar diperoleh dari substrat dengan kadar gula awal 18 % (b/v). Substrat dengan kadar gula awal 30 % (b/v) memiliki efisiensi biomassa terhadap rendemen etanol (Yp/x) yang paling besar. Konsumsi gula oleh khamir yang paling banyak terdapat pada fermentasi dengan konsentrasi gula awal 30 dan 36 % (b/v) dengan nilai yang tidak berbeda secara signifikan. Sisa gula yang paling banyak terdapat pada substrat dengan konsentrasi gula awal 36 % (b/v).
Berdasarkan hasil analisis biomassa pada fermentasi tahap pendahuluan, maka konsentrasi gula yang dipilih untuk penelitian utama adalah 36 % (b/v). Hal ini karena fermentasi menggunakan substrat dengan konsentrasi gula awal 36 % (b/v) menghasilkan jumlah biomassa paling banyak. Asumsi yang digunakan adalah pada kondisi fermentasi yang sama, media yang terdapat jumlah biomassa lebih banyak di dalamnya akan dapat menghasilkan rendemen etanol lebih banyak pula. Selain itu substrat dengan konsentrasi gula awal 36 % (b/v) menghasilkan total gula sisa yang paling banyak. Ketika kondisi fermentasi diubah dari aerob menjadi anaerob, total gula sisa tersebut diharapkan akan digunakan seluruhnya oleh khamir dalam proses fermentasi menjadi etanol.